[發(fā)明專利]一種仲丁醇耐受菌株及其篩選方法和應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210512411.X
• 申請日: 2012-12-04
• 公開（公告）號: CN102978141A
• 公開（公告）日: 2013-03-20
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 楊洪江;石禮濤
• 申請（專利權(quán)）人: 天津科技大學(xué)
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12Q1/68;C12Q1/04;C02F3/34;B09C1/10;C12R1/01
• 代理公司: 天津盛理知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 12209
• 代理人: 王來佳

1.一種仲丁醇耐受菌株，其特征在于：名稱為S-2，分類名稱為Lysinibacillus?fusiformis，保藏編號為：CGMCC?No.?6769，保藏日期：?2012?年?11?月?2?日，保藏地址為：北京市朝陽區(qū)大屯路?中國科學(xué)院微生物研究所，保藏單位：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心。

2.如權(quán)利要求1所述的仲丁醇耐受菌株在構(gòu)建產(chǎn)仲丁醇工程菌株中的應(yīng)用。

3.如權(quán)利要求1所述的仲丁醇耐受菌株在仲丁醇污染的生物修復(fù)中的應(yīng)用。

4.一種如權(quán)利要求1所述的仲丁醇耐受菌株的篩選方法，其特征在于：從不同環(huán)境樣品中，通過含有不同濃度仲丁醇的富集培養(yǎng)基及耐受培養(yǎng)基進行篩選，并使用菌株的相對生長率作為指標篩選仲丁醇耐受菌株。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的仲丁醇耐受菌株的篩選方法，其特征在于：具體步驟如下：

⑴從不同生態(tài)環(huán)境中采集樣品得不同環(huán)境樣品；

⑵仲丁醇耐受菌株的富集與分離：將不同環(huán)境樣品混合后使用生理鹽水充分溶解，取上清液置于含有仲丁醇的富集培養(yǎng)基中在搖床上恒溫培養(yǎng)后，吸取部分上清液重新置于新鮮的富集培養(yǎng)基中，如此重復(fù)三代；取富集后的菌懸液涂布在含有仲丁醇的固體富集培養(yǎng)基上培養(yǎng)，分離單菌落，得分離菌株；

⑶篩選菌株的耐受性分析：將分離菌株分別接種到含有仲丁醇的耐受培養(yǎng)基中，以不含仲丁醇的作為對照，培養(yǎng)24?h，用分光光度計在600?nm波長下測每株菌的菌體密度，并計算菌體的相對生長率，相對生長率達到0.29?g/(L·h)以上的菌株即為仲丁醇耐受菌株。

6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的仲丁醇耐受菌株的篩選方法，其特征在于：所述不同環(huán)境樣品為山東或河北或天津地區(qū)的土壤、污泥、沼氣池、臭水溝或海水。

7.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的仲丁醇耐受菌株的篩選方法，其特征在于：所述富集培養(yǎng)基為：KH₂PO₄?0.5?g/L，K₂HPO₄?0.5?g/L，F(xiàn)eSO₄·7H₂O?0.01?g/L，MgSO₄?0.2?g/L，NaCl?9g/L，酵母粉5?g/L，葡萄糖?30?g/L，仲丁醇?5?g/L，?pH?7.0，1×10⁵?Pa、115?oC，滅菌20?min；

所述耐受培養(yǎng)基為：NaCl?10?g/L，蛋白胨?10?g/L，酵母粉5?g/L，質(zhì)量濃度分別為0.5%或1%或1.5%的仲丁醇，pH?7.0，1×10⁵?Pa、121?oC，滅菌20?min。

8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的仲丁醇耐受菌株的篩選方法，其特征在于：還包括對篩選所得仲丁醇耐受菌株進行降解性分析。

9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的仲丁醇耐受菌株的篩選方法，其特征在于：所述對篩選所得仲丁醇耐受菌株進行降解性分析的步驟如下：

將分離的菌株分別接種到含有不同濃度仲丁醇的LB培養(yǎng)基和基本培養(yǎng)基上，對照組為接入與菌體量相等的生理鹽水，培養(yǎng)24小時后，檢測發(fā)酵液及對照組的仲丁醇剩余量，計算得菌株對仲丁醇的降解率。

10.根據(jù)權(quán)利要求5所述的仲丁醇耐受菌株的篩選方法，其特征在于：還包括對篩選所得仲丁醇耐受菌株進行菌種鑒定，步驟如下：

⑴DNA提取方法：苯酚-氯仿-異戊醇法抽提；

⑵16S?rRNA引物：正向引物：SEQ?NO.1，反向引物：SEQ?NO.2；

⑶PCR反應(yīng)體系：10×Reaction?Buffer?5.0?μL，

dNTP???2.5?mmol/L?4.0?μL，

正向引物??10?uMol/L??1.0?μL，

反向引物??10?μMol/L??1.0μL，

Taq聚合酶??5?U/μL??0.8?μL，

DMSO?1?μL，

模版DNA??50?ng/μL??2.0?μL，

補加重蒸水至50?μL；

⑷PCR擴增程序：94oC?5?min；94oC?40s；51oC?2?min；72oC?3?min?30個循環(huán)；72oC?15?min；4oC?2?h；

⑸數(shù)據(jù)處理：凝膠純化PCR，使用NCBI?Blast分析分離菌株的同源性，并使用Ribosomal?Database?ProjectⅡ軟件Classifier，對分離的菌株進行分類。