[發明專利]一種仲丁醇耐受菌株及其篩選方法和應用

有效

• 申請號: 201210512411.X
• 申請日: 2012-12-04
• 公開（公告）號: CN102978141A
• 公開（公告）日: 2013-03-20
• 發明（設計）人: 楊洪江;石禮濤
• 申請（專利權）人: 天津科技大學
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12Q1/68;C12Q1/04;C02F3/34;B09C1/10;C12R1/01
• 代理公司: 天津盛理知識產權代理有限公司 12209
• 代理人: 王來佳

技術領域

本發明屬于微生物技術領域，涉及仲丁醇耐受菌株，尤其是一種仲丁醇耐受菌株及其篩選方法和應用。

背景技術

仲丁醇有很多用途，可以作為工業溶劑、乳化劑、染料、分散劑、脫水劑、脫漆劑和工業洗滌劑。另外，仲丁醇也可作為提高汽油辛烷值的組分、增塑劑、選礦劑和除草劑。

工業上大規模生產仲丁醇主要依靠1-丁烯和2-丁烯的水合法來生產。目前仲丁醇的產量達到90萬噸/年，而生產廠家主要集中于歐洲和美國。

仲丁醇不能直接用發酵法來生產，生產方法主要是化學法：首先，碳源經過一系列的代謝途徑轉化為2,?3-丁二醇；其次，2,?3-丁二醇在酶的作用下脫水生成甲乙酮（MEK）；最后，甲乙酮通過氫化反應轉化為仲丁醇。

據報道，一些乳酸桿菌能夠利用2,?3-丁二醇生產仲丁醇。然而，目前仍未發現在細菌中存在仲丁醇合成的基因和生物化學方面的證據，在自然界的微生物中并沒有發現仲丁醇的合成途徑。

通過檢索，并未發現與本專利申請相關的專利公開文獻。

發明內容

本發明的目的在于克服現有技術的不足之處，提供了一種具有較高的仲丁醇耐受能力及較強的仲丁醇降解能力的仲丁醇耐受菌株，該菌株可應用于構建產仲丁醇工程菌株和仲丁醇污染的生物修復；也提供了一種從自然界中富集和分離耐受和降解仲丁醇菌株的篩選方法。

本發明實現目的的技術方案如下：

一種仲丁醇耐受菌株，名稱為S-2，分類名稱為Lysinibacillus?fusiformis，保藏編號為：CGMCC?No.?6769，保藏日期：?2012?年?11?月?2?日，保藏地址為：北京市朝陽區大屯路?中國科學院微生物研究所，保藏單位：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心。

如上所述的仲丁醇耐受菌株在構建產仲丁醇工程菌株中的應用。

如上所述的仲丁醇耐受菌株在仲丁醇污染的生物修復中的應用。

如上所述的仲丁醇耐受菌株的篩選方法，從不同環境樣品中，通過含有不同濃度仲丁醇的富集培養基及耐受培養基進行篩選，并使用菌株的相對生長率作為指標篩選仲丁醇耐受菌株。

而且，所述仲丁醇耐受菌株的篩選方法，具體步驟如下：

⑴從不同生態環境中采集樣品得不同環境樣品；

⑵仲丁醇耐受菌株的富集與分離：將不同環境樣品混合后使用生理鹽水充分溶解，取上清液置于含有仲丁醇的富集培養基中在搖床上恒溫培養后，吸取部分上清液重新置于新鮮的富集培養基中，如此重復三代；取富集后的菌懸液涂布在含有仲丁醇的固體富集培養基上培養，分離單菌落，得分離菌株；

⑶篩選菌株的耐受性分析：將分離菌株分別接種到含有仲丁醇的耐受培養基中，以不含仲丁醇的作為對照，培養24?h，用分光光度計在600?nm波長下測每株菌的菌體密度，并計算菌體的相對生長率，相對生長率達到0.29?g/(L·h)以上的菌株即為仲丁醇耐受菌株。

而且，所述不同環境樣品為山東或河北或天津地區的土壤、污泥、沼氣池、臭水溝或海水。

而且，所述富集培養基為：KH₂PO₄?0.5?g/L，K₂HPO₄?0.5?g/L，FeSO₄·7H₂O?0.01?g/L，MgSO₄?0.2?g/L，NaCl?9g/L，酵母粉5?g/L，葡萄糖?30?g/L，仲丁醇?5?g/L，?pH?7.0，1×10⁵?Pa、115?oC，滅菌20?min；

所述耐受培養基為：NaCl?10?g/L，蛋白胨?10?g/L，酵母粉5?g/L，質量濃度分別為0.5%或1%或1.5%的仲丁醇，pH?7.0，1×10⁵?Pa、121?oC，滅菌20?min。

而且，還包括對篩選所得仲丁醇耐受菌株進行降解性分析。

而且，所述對篩選所得仲丁醇耐受菌株進行降解性分析的步驟如下：

將分離的菌株分別接種到含有不同濃度仲丁醇的LB培養基和基本培養基上，對照組為接入與菌體量相等的生理鹽水，培養24小時后，檢測發酵液及對照組的仲丁醇剩余量，計算得菌株對仲丁醇的降解率。

而且，還包括對篩選所得仲丁醇耐受菌株進行菌種鑒定，步驟如下：

⑴DNA提取方法：苯酚-氯仿-異戊醇法抽提；

⑵16S?rRNA引物：正向引物：SEQ?NO.1，反向引物：SEQ?NO.2；