[發明專利]一種ERβ基因缺陷對eNOS-NO通路表達影響的檢測方法

無效

• 申請號: 201210511547.9
• 申請日: 2012-12-04
• 公開（公告）號: CN102965440A
• 公開（公告）日: 2013-03-13
• 發明（設計）人: 潘連軍;馬潔樺
• 申請（專利權）人: 南京市婦幼保健院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;G01N27/447
• 代理公司: 南京眾聯專利代理有限公司 32206
• 代理人: 顧進

技術領域

本發明涉及組織化學檢測的方法，特別地，本發明涉及一種ERβ基因缺陷對eNOS-NO通路表達影響的檢測方法。?

背景技術

血管內皮在陰莖的勃起過程中扮演了十分重要的角色,?血管內皮功能障礙是陰莖勃起功能障礙(ED)的病理基礎之一,?并且，ED的發生往往早于其他伴有明顯內皮損傷的心血管疾病如冠心病等，被認為是此類疾病的早期警報器。血管內皮細胞是循環血液與血管平滑肌細胞間的機械屏障，容易受到體內外多種因素如高血壓、高血脂、高血糖、氧化應激、高同型半胱氨酸血癥、吸煙等的損傷，受損后的血管內皮細胞功能尤其是內分泌功能失調，使其分泌的多種活性物質或是與這些活性物質有關的其他物質之間的平衡被打破，從而導致內皮損傷/功能障礙。?

保護陰莖血管內皮是勃起功能障礙治療的新途徑。現有研究證實,?雌激素通過直接效應(改善內皮功能、抑制血管平滑肌增殖、遷移)和間接效應(調節脂代謝、改善凝血纖溶系統功能和抗氧化作用)?改善血管功能，減弱有害刺激的細胞反應，是重要的心血管保護因素，雌激素是通過其受體對心血管內皮具有保護效應,?缺乏雌激素或其受體,?血管內皮易受損傷。雌激素受體(estrogenreceptor,?ER)包括α和β2個亞型,?在血管內均有表達,?近年研究發現，陰莖海綿體內也存在ER，在包括嚙齒類動物、兔等多個物種的陰莖中發現有ERα和ERβ的表達，且以ERβ為主。雌激素通過ER介導的血管保護作用涉及到與血管張力調控、內皮細胞凋亡、氧化應激、炎癥反應、內皮祖細胞的增值與粘附等有關的多種分子，其中對內皮源性一氧化氮合酶?-?一氧化氮(eNOS-NO)途徑相關分子的調控至關重要，此信號途徑主要參與的蛋白有eNOS、小窩蛋白-1(caveolin-1)和鈣調蛋白(Cam)，如何檢測此信號途徑中蛋白表達及含量的變化成為研究ERβ基因缺陷對eNOS-NO通路表達影響的重要問題。?

發明內容

本發明目的在于：通過檢測eNOS-NO通路中參與蛋白的表達及含量變化，進而提供一種ERβ基因缺陷對eNOS-NO通路表達影響的檢測方法。?

本發明采取的技術方案為：一種ERβ基因缺陷對eNOS-NO通路表達影響的檢測方法，包括檢測eNOS、Cam和小窩蛋白-1相關mRNA表達量，和檢測eNOS、Cam和小窩蛋白-1三種蛋白量。?

所述eNOS、Cam和小窩蛋白-1相關mRNA表達量的檢測，包括如下步驟：?

1)?組織總RNA的提?。?/p>

A.?選擇剛剛死亡的ERβ缺陷型動物和正常動物，取部分陰莖中段組織凍存于液氮中，檢測時從液氮中取凍存的陰莖組織，加入0.5?ml?TRIzol試劑和液氮，充分研磨，直至陰莖組織成粉末狀，最后補加0.5?ml?TRIzol試劑，室溫下靜置5?min，保證樣品體積不應超過TRIzol體積的10％，然后于4?℃，12000×g離心15?min；

B.?取上清液置另一EP管中，每管加入0.2?ml氯仿，劇烈震蕩15?s混勻；

C.?將勻漿的樣品在室溫下放置2～3?min，使核酸蛋白復合物完全分離，然后于?4?℃，12000?×g離心15?min；

D.?經離心后的樣品分為三層，底層為黃色的有機相，上層為無色的水相和一個中間層，RNA主要存在于水相中，將水相轉移到新的EP管中，加入等體積的異丙醇沉淀水相中的RNA，混勻并于室溫放置10?min；

E.?于4?℃，12000?×g離心10?min，離心管底部會出現膠狀RNA沉淀；

F.?移去上清，每管加入1?ml?75%?的乙醇洗滌RNA沉淀，混勻，于4?℃，7600×g離心5?min；

G.?移去上清，沉淀在室溫下干燥10?min，用適量的DEPC水溶解RNA沉淀,?用分光光度計測其濃度及純度，取適量總RNA稀釋后測定A₂₆₀和A₂₈₀的比值，計算RNA的濃度；

H.?取8?μl?RNA樣品用1.0%瓊脂糖進行電泳，觀察RNA的完整性；

2）反轉錄