[發明專利]一種ERβ基因缺陷對eNOS-NO通路表達影響的檢測方法

無效

• 申請號: 201210511547.9
• 申請日: 2012-12-04
• 公開（公告）號: CN102965440A
• 公開（公告）日: 2013-03-13
• 發明（設計）人: 潘連軍;馬潔樺
• 申請（專利權）人: 南京市婦幼保健院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;G01N27/447
• 代理公司: 南京眾聯專利代理有限公司 32206
• 代理人: 顧進

1.一種ERβ基因缺陷對eNOS-NO通路表達影響的檢測方法，包括檢測eNOS、Cam和小窩蛋白-1相關mRNA表達量，和檢測eNOS、Cam和小窩蛋白-1三種蛋白量。

2.根據權利要求1所述的ERβ基因缺陷對eNOS-NO通路表達影響的檢測方法，其特征在于：所述eNOS、Cam和小窩蛋白-1相關mRNA表達量的檢測，包括如下步驟：

1)?組織總RNA的提取：

A.?選擇剛剛死亡的ERβ缺陷型動物和正常動物，取部分陰莖中段組織凍存于液氮中，檢測時從液氮中取凍存的陰莖組織，加入0.5?ml?TRIzol試劑和液氮，充分研磨，直至陰莖組織成粉末狀，最后補加0.5?ml?TRIzol試劑，室溫下靜置5?min，保證樣品體積不應超過TRIzol體積的10％，然后于4?℃，12000×g離心15?min；

B.?取上清液置另一EP管中，每管加入0.2?ml氯仿，劇烈震蕩15?s混勻；

C.?將勻漿的樣品在室溫下放置2～3?min，使核酸蛋白復合物完全分離，然后于?4?℃，12000?×g離心15?min；

D.?經離心后的樣品分為三層，底層為黃色的有機相，上層為無色的水相和一個中間層，RNA主要存在于水相中，將水相轉移到新的EP管中，加入等體積的異丙醇沉淀水相中的RNA，混勻并于室溫放置10?min；

E.?于4?℃，12000?×g離心10?min，離心管底部會出現膠狀RNA沉淀；

F.?移去上清，每管加入1?ml?75%?的乙醇洗滌RNA沉淀，混勻，于4?℃，7600×g離心5?min；

G.?移去上清，沉淀在室溫下干燥10?min，用適量的DEPC水溶解RNA沉淀,?用分光光度計測其濃度及純度，取適量總RNA稀釋后測定A₂₆₀和A₂₈₀的比值，計算RNA的濃度；

H.?取8?μl?RNA樣品用1.0%瓊脂糖進行電泳，觀察RNA的完整性；

2）反轉錄：

使用Fermentas第一鏈cDNA合成試劑盒進行反轉錄反應，反應體系如下：

?5×Reaction buffer4.0 μl10 mmol/L dNTP2.0 μlOlig(dT)18引物1.0 μlRNA酶抑制劑1.0 μlM-MuLV反轉錄酶(200 U /μl)1.0 μlRNA模板1 μg無核酶水補至20 μl

反應條件為：42?℃反應60?min，70?℃?5?min?滅活，產物于-20?℃保存待用；

3）聚合酶鏈式反應

在Genbank上查找小鼠Cam、caveolin-1、eNOS及β-actin的mRNA序列，取其保守區，使用primer?5.0軟件對引物進行設計，引物序列為：

?

反應體系如下：

2×Taq酶PCR反應混合液12.5 μl引物1(20 μmol/L)1.5 μl引物2(20 μmol/L)1.5 μlcDNA模板2.0 μlddH₂O7.5 μl

反應條件為：94?℃預變性5?min，94?℃變性30?s，退火30?s，72?℃延伸時間30?s，30～35?個循環，72?℃延伸10?min；

4）電泳及觀察分析

PCR產物采用10?V/cm的電壓，在1%瓊脂糖凝膠上電泳，電泳完成后,?采用凝膠電泳成像分析系統觀察、拍照，用Quantity-One軟件分析目的基因和內參基因，即β-actin的灰度，以目的基因/β-actin的比值表示目的基因的相對表達量。