[發(fā)明專利]一種檢測雌激素受體對陰莖血管內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)作用的方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210511341.6
• 申請日: 2012-12-04
• 公開（公告）號: CN102980995A
• 公開（公告）日: 2013-03-20
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 潘連軍;馬潔樺
• 申請（專利權(quán)）人: 南京市婦幼保健院
• 主分類號: G01N33/531
• 分類號: G01N33/531;G01N1/30
• 代理公司: 南京眾聯(lián)專利代理有限公司 32206
• 代理人: 顧進(jìn)

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及組織化學(xué)檢測的方法，特別地，本發(fā)明涉及一種檢測雌激素受體對陰莖血管內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)作用的方法。

背景技術(shù)

血管內(nèi)皮在陰莖的勃起過程中扮演了十分重要的角色,?血管內(nèi)皮功能障礙是陰莖勃起功能障礙(ED)的病理基礎(chǔ)之一,?并且，ED的發(fā)生往往早于其他伴有明顯內(nèi)皮損傷的心血管疾病如冠心病等，被認(rèn)為是此類疾病的早期警報器。血管內(nèi)皮細(xì)胞是循環(huán)血液與血管平滑肌細(xì)胞間的機械屏障，容易受到體內(nèi)外多種因素如高血壓、高血脂、高血糖、氧化應(yīng)激、高同型半胱氨酸血癥、吸煙等的損傷，受損后的血管內(nèi)皮細(xì)胞功能尤其是內(nèi)分泌功能失調(diào)，使其分泌的多種活性物質(zhì)或是與這些活性物質(zhì)有關(guān)的其他物質(zhì)之間的平衡被打破，從而導(dǎo)致內(nèi)皮損傷/功能障礙。

保護(hù)陰莖血管內(nèi)皮是勃起功能障礙治療的新途徑。現(xiàn)有研究證實,?雌激素通過直接效應(yīng)(改善內(nèi)皮功能、抑制血管平滑肌增殖、遷移)和間接效應(yīng)(調(diào)節(jié)脂代謝、改善凝血纖溶系統(tǒng)功能和抗氧化作用)?改善血管功能，減弱有害刺激的細(xì)胞反應(yīng)，是重要的心血管保護(hù)因素，雌激素是通過其受體對心血管內(nèi)皮具有保護(hù)效應(yīng),?缺乏雌激素或其受體,?血管內(nèi)皮易受損傷。雌激素受體(estrogenreceptor,?ER)包括α和β2個亞型,?在血管內(nèi)均有表達(dá),?近年研究發(fā)現(xiàn)，陰莖海綿體內(nèi)也存在ER，在包括嚙齒類動物、兔等多個物種的陰莖中發(fā)現(xiàn)有ERα和ERβ的表達(dá)，且以ERβ為主。

內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)具兩種標(biāo)志蛋白表達(dá)：CD34和vWF，其中CD34分子屬于鈣粘蛋白家族，是一種相對分子質(zhì)量為105000-120000高度糖基化的跨膜蛋白，選擇性地表達(dá)于人類及其他哺乳動物造血干細(xì)胞、祖細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞；vWF做為內(nèi)皮細(xì)胞合成和分泌的一種糖蛋白，在內(nèi)皮細(xì)胞損傷時釋放入血增加，內(nèi)皮中vWF含量降低。在眾多內(nèi)皮標(biāo)志蛋白中，CD34和vWF更具敏感?性和特異性，因此CD34和vWF可以作為反映內(nèi)皮細(xì)胞功能狀態(tài)和損傷程度的指標(biāo)。因此，如何根據(jù)內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)的標(biāo)志蛋白檢驗內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的功能狀態(tài)和損傷程度，成為檢測雌激素受體保護(hù)陰莖血管內(nèi)皮作用的重要問題。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明目的在于：根據(jù)內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)的標(biāo)志蛋白提供一種檢驗內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的功能狀態(tài)和損傷程度，進(jìn)而提供一種檢測雌激素受體ERβ對陰莖血管內(nèi)皮的保護(hù)作用的方法。

本發(fā)明采取的技術(shù)方案為：一種檢測雌激素受體對陰莖血管內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)作用的方法，包括如下步驟：

(一)、石蠟切片制作

（1）固定：選擇剛剛死亡的ERβ缺陷型動物和正常動物，取部分陰莖中段組織，用PBS沖洗，放入固定液4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液內(nèi)固定12h；

（2）脫水：倒去固定液，將組織用蒸餾水沖洗3次，再用50%酒精沖洗2次，用酒精逐級脫水：70%酒精1天，80%酒精過夜，95%酒精3h，無水酒精Ⅰ、無水酒精Ⅱ各2h；

（3）透明：脫水后的組織于體積比為1:1的無水酒精和二甲苯混合液內(nèi)透明45min，二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ內(nèi)透明各30min；

（4）包埋：恒溫箱內(nèi)將透明后的組織浸入石蠟，58℃的體積比為1:1二甲苯和石蠟混合液45min，石蠟Ⅰ、石蠟Ⅱ、石蠟Ⅲ共2.5h后，用石蠟Ⅲ包埋組織；

（5）切片：包埋后的組織塊經(jīng)修整后，用切片機切成3-5μm的石蠟帶；

（6）貼片：將石蠟帶在50℃溫水中展片，然后預(yù)處理干凈的載玻片撈片，組織帶可黏在載玻片上；??????

（7）烤片：68℃恒溫箱內(nèi)烤帶有組織帶的載玻片2h；

(二)、免疫組化SP三步法

（1）脫蠟：脫蠟前應(yīng)將沾有組織的載玻片在室溫中放置60min，或60℃恒溫箱中烘烤20min，后用二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ浸泡，共25min；

（2）水化：脫蠟后的載玻片在無水酒精Ⅰ、無水酒精Ⅱ各水化2min，下行至95%酒精、80%酒精、70%酒精Ⅰ和70%酒精Ⅱ各水化2min；

（3）水化后的載玻片用PBS沖洗2-3次，每次5min；

（4）阻斷：3%H₂O₂去離子水或80%甲醇孵育沖洗后的載玻片10min，以滅活內(nèi)源性過氧化物酶活性；

（5）PBS沖洗2-3次，每次5min；

（6）抗原修復(fù)：載玻片置PH?6.0、溫度為95℃的抗原修復(fù)液中修復(fù)15-20min，自然冷卻20min以上，再用冷水沖洗缸子，加快冷卻至室溫；

（7）PBS沖洗2-3次，每次5min；

（8）封閉：向載玻片上組織滴加正常山羊血清封閉液，室溫孵育20min，甩去多余液體；