[發明專利]一種檢測雌激素受體對陰莖血管內皮細胞保護作用的方法

無效

• 申請號: 201210511341.6
• 申請日: 2012-12-04
• 公開（公告）號: CN102980995A
• 公開（公告）日: 2013-03-20
• 發明（設計）人: 潘連軍;馬潔樺
• 申請（專利權）人: 南京市婦幼保健院
• 主分類號: G01N33/531
• 分類號: G01N33/531;G01N1/30
• 代理公司: 南京眾聯專利代理有限公司 32206
• 代理人: 顧進

1.一種檢測雌激素受體對陰莖血管內皮細胞保護作用的方法，首先將組織做成石蠟切片，再通過免疫組化三步法進行染色顯色。

2.根據權利要求1所述檢測雌激素受體對陰莖血管內皮細胞保護作用的方法，包括如下步驟：

（一）、石蠟切片制作

（1）固定：選擇剛剛死亡的ERβ缺陷型動物和正常動物，取部分陰莖中段組織，用PBS沖洗，放入固定液4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液內固定12h；

（2）脫水：倒去固定液，將組織用蒸餾水沖洗3次，再用50%酒精沖洗2次，用酒精逐級脫水：70%酒精1天，80%酒精過夜，95%酒精3h，無水酒精Ⅰ、無水酒精Ⅱ各2h；

（3）透明：脫水后的組織于體積比為1:1的無水酒精和二甲苯混合液內透明45min，二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ內透明各30min；

（4）包埋：恒溫箱內將透明后的組織浸入石蠟，58℃的體積比為1:1二甲苯和石蠟混合液45min，石蠟Ⅰ、石蠟Ⅱ、石蠟Ⅲ共2.5h后，用石蠟Ⅲ包埋組織；

（5）切片：包埋后的組織塊經修整后，用切片機切成3-5μm的石蠟帶；

（6）貼片：將石蠟帶在50℃溫水中展片，然后預處理干凈的載玻片撈片，組織帶可黏在載玻片上；??????

（7）烤片：68℃恒溫箱內烤帶有組織帶的載玻片2h；

(二)、免疫組化SP三步法

（1）脫蠟：脫蠟前應將沾有組織的載玻片在室溫中放置60min，或60℃恒溫箱中烘烤20min，后用二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ浸泡，共25min；

（2）水化：脫蠟后的載玻片在無水酒精Ⅰ、無水酒精Ⅱ各水化2min，下行至95%酒精、80%酒精、70%酒精Ⅰ和70%酒精Ⅱ各水化2min；

（3）水化后的載玻片用PBS沖洗2-3次，每次5min；

（4）阻斷：3%H₂O₂去離子水或80%甲醇孵育沖洗后的載玻片10min，以滅活內源性過氧化物酶活性；

（5）PBS沖洗2-3次，每次5min；

（6）抗原修復：載玻片置PH?6.0、溫度為95℃的抗原修復液中修復15-20min，自然冷卻20min以上，再用冷水沖洗缸子，加快冷卻至室溫；

（7）PBS沖洗2-3次，每次5min；

（8）封閉：向載玻片上組織滴加正常山羊血清封閉液，室溫孵育20min，甩去多余液體；

（9）滴加Ⅰ抗50μl，室溫靜置1h，或者37℃1h，或者4℃過夜后在37℃復溫45min；

（10）PBS沖洗2-3次，每次5min；

（11）滴加辣根過氧化物酶標記的Ⅱ抗40～50μl，室溫靜置1h，或37℃1h；

（12）PBS沖洗2-3次，每次5min；

（13）滴加SP即鏈霉親和素-過氧化物酶，室溫或37℃孵育30min-1h；

（14）PBS沖洗2-3次，每次5min；

（15）顯色：DAB顯色劑5-10min，在顯微鏡下掌握染色程度，胞漿呈棕色者判定為陽性細胞；

（16）自來水沖洗10分鐘終止反應；

（17）復染：蘇木精復染2min，鹽酸酒精分化；

（18）自來水沖洗10-15min；

（19）常規脫水、透明、封固液封片和鏡檢，其中封片方式為用中性樹膠滴在組織旁邊，再用蓋玻片蓋上。

3.根據權利要求2所述檢測雌激素受體對陰莖血管內皮細胞保護作用的方法，其特征在于：所述PBS為pH7.4?、0.01M的磷酸鹽緩沖液，由NaCl?8g，KCl?0.2g，Na₂HPO₄·12H₂O?3.63g或Na₂HPO₄?1.44g，?以及KH₂PO₄?0.24g，溶于900ml雙蒸水中，用鹽酸調pH值至7.4，加水定容至1L配制而成。