[發明專利]一種獲得植物候選抗病基因序列的方法

有效

• 申請號: 201210511335.0
• 申請日: 2012-12-04
• 公開（公告）號: CN102965367A
• 公開（公告）日: 2013-03-13
• 發明（設計）人: 王紅梅;趙云雷;陳偉;李運海;龔海燕;桑曉慧
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院棉花研究所
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C12Q1/68
• 代理公司: 北京天奇智新知識產權代理有限公司 11340
• 代理人: 劉黎明

技術領域

本發明屬于生物技術領域，尤其涉及一種獲得植物候選抗病基因序列的方法。

背景技術

植物病害是農林業生產的主要限制因子之一，人類克服植物病害的主要途徑之一是利用抗性資源，通過傳統育種的方法培育抗病品種，但由于植物抗病性的復雜性以及人們對植物與病原互作機制認識的匱乏，再加上傳統育種途徑本身的局限性，抗病育種一直是農林業生產上的難題。隨著分子生物學技術的發展，通過克隆植物的抗病基因，使得人們對寄主與病原相互作用的分子機理的研究得到了迅速發展，為抗病基因在生產上的應用進行了有益的探索并展示了誘人的前景。與傳統育種方法相比，通過克隆抗病基因并利用轉基因技術培育抗病植物品種，可以大大縮短抗病育種的年限并提高育種效率。獲得抗病基因的前提是高效率的獲取候選抗病基因序列，經過基因功能的鑒定后從候選抗病基因序列中篩選出與植物抗病性相關的抗病基因，經過甄別后，再有選擇的進行下游的轉基因育種實驗。

獲得植物候選抗病基因序列的方法主要有轉座子標簽技術和圖位克隆技術，但是由于多拷貝基因的存在以及插入位點的隨機性極大地限制了轉座子標簽法的應用范圍，而圖位克隆法需要構建高密度的分子標記遺傳圖譜,這限制了該方法的廣泛應用。隨著功能基因組學和生物信息學知識的發展,出現了一些新的候選抗病基因發掘方法，其中利用同源序列法分離克隆候選抗病基因序列成為一條很受重視的途徑，但由于抗病基因具有成簇分布的現象，所以需要展開大量工作以確定克隆的候選基因序列片段是否為目的基因，且還存在許多與抗病基因序列同源而卻與抗病性無關的基因序列干擾，因此在許多植物（如棉花）中尚未利用同源序列法克隆得到明確的抗病基因。

由于一些植物基因組比較大，遺傳連鎖圖譜不飽和，通過圖位克隆方法分離克隆植物候選抗病基因比較困難，而且由于很多植物的遺傳轉化體系不完善，利用轉座子標簽技術克隆候選抗病基因還有一定的難度。當前植物候選抗病基因序列的克隆，主要還是采用同源序列法，目前盡管利用同源序列法獲得了大量的候選抗病基因序列片段，但是這些序列并不都與抗病性相關,所以確定克隆的基因序列片段是否為目的基因,還需要進行大量的分析工作，且同源克隆一般是從cDNA水平上克隆候選基因，需要提取高質量的RNA進行反轉錄實驗，程序繁瑣，RNA的穩定性也不高。

如何快速、有效的發掘獲得植物候選抗病基因序列，是開展植物抗病基因克隆工作的前提，對于植物抗病基因全長序列的獲得及開展抗病基因工程育種具有重要的作用。

甲基化是真核細胞DNA修飾的方式之一，在植物生長發育及對逆境脅迫響應中起著重要的作用，在DNA序列中有多個位點可發生甲基化。近年來的研究表明，逆境對DNA的甲基化水平會造成影響，許多受甲基化變化誘導的基因與脅迫反應相關，DNA甲基化是目前植物抗逆機制的研究熱點之一。甲基化敏感擴增多態性技術是研究基因組甲基化水平的一個有力工具，利用甲基化敏感擴增多態性技術可以分析基因組甲基化程度的變化，還可以對甲基化狀態變化的位點進行序列分析。現有研究表明，當植物受到病害脅迫之后，其基因組的DNA甲基化會發生改變，并且病菌誘導的甲基化改變發生在功能基因位點的編碼區，這個研究結果給予發明人啟示：使用甲基化敏感擴增多態性技術，再結合基于已知植物抗病基因保守結構域序列設計的引物，可以快速、有效的從DNA水平上發掘植物候選抗病基因序列。

發明內容

本發明的目的在于開發了利用抗性基因同源序列引物錨定的甲基化分析技術獲得植物候選抗病基因序列的方法，該方法簡化了植物病原菌誘導下的常規甲基化敏感擴增多態性分析技術，并結合所設計的抗性基因同源序列引物，可以在基因組DNA水平上快速察覺病菌誘導的基因片段，通過回收、克隆和測序，快速發掘植物候選抗病基因序列。

本發明所述的方法含有以下步驟：

(1)根據已克隆的植物抗病基因保守結構域序列設計抗性基因同源序列引物，所述抗性基因同源序列引物為SEQ?ID?NO:39～SEQ?ID?NO:138所示。

(2)提取接種病原菌后的植物基因組DNA，以未接種病原菌或接種清水的植物基因組DNA為對照，進行抗性基因同源序列引物錨定的甲基化敏感擴增多態性分析，具體如下：