[發(fā)明專利]一種獲得植物候選抗病基因序列的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210511335.0
• 申請日: 2012-12-04
• 公開（公告）號: CN102965367A
• 公開（公告）日: 2013-03-13
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王紅梅;趙云雷;陳偉;李運(yùn)海;龔海燕;桑曉慧
• 申請（專利權(quán)）人: 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C12Q1/68
• 代理公司: 北京天奇智新知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11340
• 代理人: 劉黎明

1.一種獲得植物候選抗病基因序列的方法，該方法包括：

(1)根據(jù)已克隆的植物抗病基因保守結(jié)構(gòu)域序列設(shè)計(jì)抗性基因同源序列引物；

(2)提取接種病原菌后的植物植株基因組DNA，以未接種病原菌或接種清水的植物基因組DNA為對照，進(jìn)行抗性基因同源序列引物錨定的甲基化敏感擴(kuò)增多態(tài)性分析，得到受病菌誘導(dǎo)的多態(tài)性條帶；

(3)回收上述步驟(2)中所述受病原菌誘導(dǎo)的多態(tài)性條帶，并進(jìn)行PCR擴(kuò)增、克隆、測序；

(4)將測定的序列與已知的抗病反應(yīng)基因進(jìn)行同源性比對，與已知的抗病反應(yīng)基因高度同源的序列即為候選抗病基因序列。

2.按照權(quán)利要求1所述方法，其特征在于：

所述抗性基因同源序列引物為SEQ?ID?NO:39～SEQ?ID?NO:138所示。

3.按照權(quán)利要求1所述方法，其特征在于：在接種病原菌后24h～48h之間提取植物植株基因組DNA。

4.按照權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，步驟(2)包括：

(a)采用一組限制性內(nèi)切酶Hpa?II+EcoR?I對供試材料基因組DNA進(jìn)行雙酶切，將所得的酶切產(chǎn)物與接頭連接；

(b)將上述步驟(a)獲得的連接產(chǎn)物作為預(yù)擴(kuò)增模版，使用預(yù)擴(kuò)增引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增；

(c)將上述步驟(b)獲得的預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物作為選擇性擴(kuò)增模版，進(jìn)行選擇性擴(kuò)增，在選擇性擴(kuò)增中所使用的引物分為三組：抗性基因同源序列引物、EcoR?I選擇性擴(kuò)增引物和HpaⅡ/MspⅠ選擇性擴(kuò)增引物，所述EcoRⅠ選擇性擴(kuò)增引物和HpaⅡ/MspⅠ選擇性擴(kuò)增引物都是在常規(guī)甲基化敏感擴(kuò)增多態(tài)性分析中所用的選擇性擴(kuò)增引物；將任一抗性基因同源序列引物與任一EcoRⅠ選擇性擴(kuò)增引物組合成引物對，將任一抗性基因同源序列引物與任一HpaⅡ/MspⅠ選擇性擴(kuò)增引物組合成引物對，分別使用上述兩種引物對組合來進(jìn)行PCR擴(kuò)增；

(d)將上述步驟(c)獲得的選擇性擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過電泳分離、染色后進(jìn)行譜帶的觀察，統(tǒng)計(jì)分析受病原菌誘導(dǎo)的多態(tài)性條帶和擴(kuò)增出受病原菌誘導(dǎo)的多態(tài)性條帶時(shí)所用的引物對。

5.按照權(quán)利要求4所述方法，其特征在于：

步驟(3)所述的PCR擴(kuò)增使用的引物為擴(kuò)增出受病原菌誘導(dǎo)的多態(tài)性條帶時(shí)所用的引物對，所述克隆為T-A克隆。

6.根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的方法，其特征在于：所述植物為棉花，所述病原菌為黃萎病病原菌。