[發明專利]一種提高抗肝片吸蟲病DNA疫苗免疫保護率的疫苗組合及制備方法

無效

• 申請號: 201210510136.8
• 申請日: 2012-12-03
• 公開（公告）號: CN103203028A
• 公開（公告）日: 2013-07-17
• 發明（設計）人: 羅洪林
• 申請（專利權）人: 西南大學
• 主分類號: A61K48/00
• 分類號: A61K48/00;A61K39/39;A61K39/00;A61P33/10;C12N15/79;C12N15/57
• 代理公司: 重慶華科專利事務所 50123
• 代理人: 康海燕

技術領域

本發明涉及一種利用提高Th2免疫反應從而提高編碼肝片吸蟲Cat?L1（FhCat?L1）DNA疫苗保護率的方法。具體涉及在構建編碼肝片吸蟲Cat?L1（FhCat?L1）DNA質粒的基礎上，利用宿主機體Th2免疫反應對蠕蟲感染具有很好的殺滅或抑制作用，選用能誘導樹突狀細胞（DC）成熟、增加DC數量和頻率的Flt3L及能誘導宿主免疫反應趨向Th2的細胞因子IL4作為DNA疫苗的分子佐劑，提高FhCat?L1?DNA疫苗在免疫BALB/c小鼠后的免疫原性和免疫保護率，為抗肝片吸蟲DNA?疫苗的研發提供一種新思路。

背景技術

肝片吸蟲是一種寄生性蠕蟲，能引起牛、羊等反芻動物及人的嚴重吸蟲病[1]。在世界范圍內，肝片吸蟲病直接影響著畜牧業的發展和人類健康，據估計每年可造成約20億美元的經濟損失[2]，是一種不可忽視的重要人畜共患寄生蟲病。對此病的防治一般采用三氯苯咪唑等化學藥物，但這些藥物只對早期的未成熟蟲體或成蟲具有良好效果，對感染后期的治療不佳。最近發現，家畜已對三氯苯咪唑等化學藥物產生耐藥性[3-5]。同時，人們對畜產品中化學藥物殘留量的要求也越來越嚴格，這給利用化學藥物控制吸蟲病帶來極大困難。因此，防治吸蟲病急切需要一種能替代化學藥物的治療方法，?這就給疫苗發展帶來了良好契機[6]。

疫苗研究的關鍵是對病原引起的機體免疫規律的了解。肝片吸蟲可引起Th1/Th2混合免疫反應，但根據此原理研究的疫苗效果卻不是很理想[7，8]。作為蠕蟲的一種，肝片吸蟲應該具有其他蠕蟲如絲蟲或其他線蟲的免疫特性，即可引起宿主以Th2為主的免疫反應[9-12]。因此，可假設能刺激機體產生Th2免疫反應的疫苗可提高抵抗肝片吸蟲感染的能力。以此假設為前提，可通過將機體免疫反應調節趨向Th2反應，從而提高抗感染能力。因此，可考慮選用能調節機體免疫反應趨向Th2的細胞因子或趨化因子。研究表明，IL4就具有此種功能，這與其介導幼稚T細胞向CD4+T細胞分化產生Th2細胞因子如IL5，IL13，IL9和?IL4密切相關[13，14]。另外，理想的疫苗應能夠刺激機體產生特異性的免疫反應，并能誘導長期持久的免疫記憶，以保護機體免受疾病侵襲。樹突狀細胞（DC），是已知體內最強的專職抗原提呈細胞，其最大的特點是能夠刺激初始T細胞增殖和啟動機體免疫反應。因此，選用能能誘導樹突狀細胞（DC）成熟，增加DC數量和頻率的細胞因子或趨化因子作為疫苗佐劑，可大大提高DC呈遞抗原的能力，從而提高疫苗的免疫保護率。Flt3L即是這樣的趨化因子，它能與DC表面分子作用，提高抗原呈遞能力[15，16]。

除此之外，優秀的疫苗候選因子也是疫苗研究的關鍵。事實上，到目前為止，有很多肝片吸蟲的疫苗候選分子如谷胱甘肽S轉移酶（GST）,?亮氨酸氨肽酶(LAP),?脂肪酸結合蛋白（FABP）及組織蛋白酶?L（Cat?L）都被用于開發諸如重組蛋白疫苗及DNA疫苗，雖然?這些疫苗能在實驗動物和大動物上產生一定的免疫保護[17，18]，但至今仍沒有一種商品化疫苗能投入到臨床生產，這在很大程度上受制于疫苗的保護率低下的現狀，而這種現狀與如何提高抗原的呈遞有著密切的關系[19-22]。?

組織蛋白酶L是一種半胱氨酸蛋白酶，通常情況下這種酶以非活性狀態存在于分泌囊泡的腸上皮細胞中[23，24]，當前體酶活化并被釋放后，?寄生蟲即可利用活化的組織蛋白酶行使多種重要的功能，如能在肝臟中將蛋白分解為多肽從而利于營養的吸收和降解基質蛋白從而有利于寄生蟲從腸道遷移到肝臟[25，26]。研究還表明，組織蛋白酶L還在免疫逃避和免疫調節中發揮重要作用。它可分解宿主的免疫球蛋白從而破壞宿主的免疫攻擊，并能介導和調節巨噬細胞的活性、抑制Th1免疫反應[27，29]。目前，對肝片吸蟲組織蛋白酶L的疫苗開發主要集中在重組蛋白疫苗和DNA疫苗的研究上。有研究表明重組肝片吸蟲組織蛋白酶L具有與天然蛋白相似的功能[30]，在荷斯坦牛身上免疫后獲得了48.2%的減蟲率和顯著升高的總IgG?[31]。DNA?疫苗是將編碼某種抗原蛋白的外源基因（DNA?或?RNA）直接導入動物體細胞內，并通過宿主細胞的表達系統合成抗原蛋白，誘導主產生對該抗原蛋白的免疫應答，以達到預防和治療疾病的目的。在DNA疫苗的研究中，大鼠罐胃免疫肝片吸蟲組織蛋白酶L?DNA疫苗并用囊蚴感染后，雖能獲得70%的免疫保護[32]，但免疫途徑操作。因此，如何提高肌肉注射DNA疫苗的保護率就成了目前DNA疫苗開發的熱點。

發明內容