[發明專利]一種氯羥吡啶膠體金層析檢測試紙條或卡

有效

• 申請號: 201210507849.9
• 申請日: 2012-11-23
• 公開（公告）號: CN103018440A
• 公開（公告）日: 2013-04-03
• 發明（設計）人: 張海棠;范國英;王自良;姜金慶;王淑云;楊雪峰;丁涵;李藝
• 申請（專利權）人: 河南科技學院
• 主分類號: G01N33/558
• 分類號: G01N33/558;G01N33/543
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及一種快速檢測微量氯羥吡啶的器具，特別是涉及一種飼料和動物源性食品中氯羥吡啶殘留分析的膠體金層析檢測試紙條或卡。

背景技術

氯羥吡啶(CLOP)，商品名為克球酚，化學名為3，5-二氯-2，6-二甲基-4-羥基吡啶，是一種預防畜、兔球蟲病的飼料藥物添加劑，長期使用或不按規定用藥會造成氯羥吡啶在動物體內和組織中殘留，具有一定的致畸性和胚胎毒性。現在，歐盟、美國、加拿大、日本以及中國、中國臺灣都規定了各種動物組織中氯羥吡啶殘留最高限量標準。我國規定了氯羥吡啶在雞肉中的殘留限量為0.01mg/kg。

組織中氯羥吡啶的檢測方法主要采用氣相色譜法(GC)、高效液相色譜法(HPLC)和氣譜/質譜聯用法(GC/MS)等。氣相色譜相對麻煩，高效液相色譜法具有簡便快速、靈敏的特點，成為分析雞肉組織中氯羥吡啶殘留的主要方法。我國規定了氯羥吡啶在雞肉中的殘留限量為0.01mg/kg，而相應標準的檢測限為0.05mg/kg，無法滿足檢測要求。同時，在樣品處理過程中，需先經葡聚糖凝膠陰離子交換柱去除干擾雜質，再過堿性氧化鋁SPE柱，不僅過程繁瑣，而且降低了的回收率。

理化分析法靈敏度高，結果準確，但是樣品需經一系列復雜的處理凈化，繁瑣費時，所需儀器設備價格昂貴，而且只有特定的專業技術人員才能操作，不能進行現場檢測，時效性差，難以推廣。酶聯免疫吸附法(ELISA)法以競爭性酶聯免疫反應為檢測原理，反應顯色后用酶標儀測定吸光值(OD)值進行結果判定。縮短了檢測時間，可以對殘留藥物進行定性定量檢測。但ELISA方法需要配套的酶標儀和配套試劑，操作過程仍較復雜，而且國內現處在研發階段，進口國外產品價格昂貴，因而ELISA方法的應用受到了較大限制。

發明內容

本發明的目的是：研制出特異、敏感、快速、簡便的氯羥吡啶殘留膠體金層析檢測試紙條和試紙卡。

一種氯羥吡啶膠體金層析檢測試紙條或卡，包括襯板和在襯板上依次銜接的樣品墊、金標結合墊、硝酸纖維素膜、玻璃吸水墊，所述金標結合墊為吸附有膠體金標記的抗氯羥吡啶單克隆抗體或多克隆抗體玻璃纖維棉，在所述硝酸纖維素膜上有用氯羥吡啶-載體蛋白偶聯物印制的隱形檢測線，用山羊抗小鼠IgG印制的隱形對照線。

所述的氯羥吡啶膠體金層析檢測試紙條或卡，所述的隱形檢測線和隱形對照線平行排列組合為“||”。

所述的試紙條或卡，所述金標物結合墊為：將1∶100～1∶500稀釋(體積比)的膠體金標記抗體吸附于玻璃纖維棉中，4℃低溫真空干燥，制備CLOP金標物結合墊。

所述的試紙條或卡，所述膠體金標記抗體制備方法為：將稀釋后的膠體金和單克隆抗體或多克隆抗體按照不同的濃度倍比，選擇膠體金顯色紅色的最小稀釋濃度作為膠體金標記抗體的最佳量，用于膠體金標記抗體的制備。

所述的試紙條或卡，所述單克隆抗體或多克隆抗體的制備方法為：

A1、氯羥吡啶半抗原的改造：親核取代反應引入酯鍵，然后在堿、酸的作用下，合成含有羧基的氯羥吡啶半抗原；

A2、CLOP-2C-載體蛋白人工抗原的合成：采用活潑酯法合成CLOP人工免疫原，稱取75mg?CLOP半抗原溶解于3mL?N，N-二甲基甲酰胺中，加入二環己基碳二亞胺35mg和N-羥基琥珀酰亞胺18mg，在室溫下磁力攪拌反應過夜12h，此液為A；稱取20mgBSA溶于2mL?0.01mol/L?pH?7.4的磷酸鹽緩沖液溶液中，此液為B；將反應液B置于磁力攪拌器上，4℃下將反應液A緩慢滴加到反應液B中，攪拌反應過夜。次日將反應液置于經過預處理的透析袋內，在PBS中攪拌透析7天，得到偶聯產物CLOP-2C-BSA，分裝上清液，凍存于-20℃冰箱中，備用；

A3、氯羥吡啶單克隆抗體和多克隆抗體的獲得：用CLOP-2C-BSA免疫6周雌性BALB/C小鼠5只，劑量為50μg/0.2mL/只，背部皮下分點注射。采用細胞融合技術無菌取脾臟制備脾細胞，在聚乙二醇-1500作用下與NS₀骨髓瘤細胞進行融合；用間接ELISA法和阻斷ELISA法進行陽性孔篩選，選擇強陽性、抑制率高、細胞生長旺盛的孔進行有限稀釋克隆化，擴大培養、凍存并鑒定，獲得一株雜交瘤細胞株；之后采用體內誘生腹水法制備CLOP?mAb；