[發(fā)明專利]轉(zhuǎn)基因構(gòu)建物及其在制備附睪頭部基因條件性敲除小鼠模型中的應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210507321.1
• 申請日: 2012-11-30
• 公開（公告）號: CN103849634B
• 公開（公告）日: 2016-10-26
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張永蓮;謝勝松;黃行許;徐娟
• 申請（專利權(quán)）人: 中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院
• 主分類號: C12N15/54
• 分類號: C12N15/54;C12N15/85;C12N5/10;A01K67/027
• 代理公司: 上海一平知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 31266
• 代理人: 祝蓮君;雷芳

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及一種轉(zhuǎn)基因構(gòu)建物及其在制備附睪頭部基因條件性敲除小鼠模型中的應(yīng)用，特別是建立了附睪頭部特定區(qū)域條件性基因敲除或過表達(dá)技術(shù)平臺。

背景技術(shù)

將外源基因?qū)雱游餀C(jī)體或深入探討基因功能需借助轉(zhuǎn)基因技術(shù)，特別地，探討基因在動物機(jī)體的功能或改良動物性狀，建立新品系等，以及研究附睪中的基因?qū)Ω讲G發(fā)育或精子成熟的功能，需要采用轉(zhuǎn)基因過表達(dá)或基因敲除技術(shù)。這些技術(shù)一方面需要轉(zhuǎn)基因打靶載體；另一方面為了實(shí)現(xiàn)控制基因在特定組織或細(xì)胞表達(dá)，需要組織特異性啟動子。

啟動子是一段特定的直接與RNA聚合酶及轉(zhuǎn)錄因子相結(jié)合、決定基因轉(zhuǎn)錄起始與否的DNA序列。因此篩選和構(gòu)建由組織特性啟動子驅(qū)動的外源蛋白的轉(zhuǎn)基因載體具有非常重要的意義。

傳統(tǒng)的基因敲除（knock?out）技術(shù)是直接破壞胚胎干細(xì)胞（ES）中的靶基因而使之失活，打靶后該基因?qū)⒃谒薪M織中失活，如果該基因?qū)ε咛グl(fā)育必需則會造成胚胎致死，這樣就難以研究其在出生后或成年時的功能。針對此缺陷，條件性基因敲除（Conditional?knock?out）技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生。條件性基因敲除主要利用了Cre/LoxP為代表的重組酶系統(tǒng)，通過組織特異性啟動子或四環(huán)素/類固醇激素受體調(diào)控系統(tǒng)控制Cre的表達(dá)，使LoxP化的靶基因被敲除，因而避免了傳統(tǒng)基因敲除方法引起的胚胎致死和復(fù)雜表型的缺陷，成為后基因組時代在體內(nèi)研究基因功能的首選技術(shù)。建立組織特異性基因剔除小鼠的方法是首先通過同源重組建立靶基因“floxed”小鼠和通過受精卵原核注射建立組織特異性表達(dá)Cre重組酶的轉(zhuǎn)基因小鼠。

目前還沒有附睪頭部特異表達(dá)Cre重組酶的轉(zhuǎn)基因小鼠，因此本領(lǐng)域迫切需要篩選和開發(fā)該種工具小鼠。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的就是提供一種轉(zhuǎn)基因構(gòu)建物及在制備附睪頭部特異表達(dá)Cre重組酶轉(zhuǎn)基因小鼠中的應(yīng)用。

本發(fā)明的另一目的是建立附睪頭部特定區(qū)域條件性基因敲除或過表達(dá)技術(shù)平臺。

在本發(fā)明的第一方面，提供了一種轉(zhuǎn)基因構(gòu)建物，所述的構(gòu)建物包括外源Cre基因以及與外源Cre基因可操作連接的啟動子元件；其中，所述的啟動子元件是脂質(zhì)運(yùn)載蛋白5（Lipocalin5）的啟動子或其活性片段，并且所述啟動子具有驅(qū)動外源Cre基因在動物附睪頭部特異表達(dá)的功能。

在另一優(yōu)選例中，所述的啟動子具有驅(qū)動外源Cre基因在動物附睪頭部中遠(yuǎn)端特異表達(dá)的功能。

在另一優(yōu)選例中，所述的動物為哺乳動物，較佳地為人、鼠、牛、羊、豬等。

在另一優(yōu)選例中，所述的啟動子元件選自下組：核苷酸序列如SEQ?ID?NO.:1所示的多核苷酸；(b)核苷酸序列與SEQ?ID?NO.:1所示序列的同源性≥95%(較佳地≥98%)，且具有驅(qū)動外源基因在動物附睪頭部中特異表達(dá)的功能的多核苷酸；(c)如SEQ?ID?NO.:1所示多核苷酸的5’端和/或3’端截短或增加1-60個(較佳地1-30，更佳地1-10個)核苷酸，且具有驅(qū)動外源基因在動物附睪頭部特異表達(dá)功能的多核苷酸。

在另一優(yōu)選例中，所述啟動子元件來源于動物的脂質(zhì)運(yùn)載蛋白5（Lipocalin5）基因。

在另一優(yōu)選例中，所述啟動子元件的序列如SEQ?ID?NO.:1所示。

在另一優(yōu)選例中，所述的轉(zhuǎn)基因構(gòu)建物還可以包括選自下組的任一基因或其組合：抗性基因、篩選標(biāo)記基因、抗原蛋白基因、RNAi基因、miRNA基因、生物制劑基因、或動物品質(zhì)相關(guān)基因。

在另一優(yōu)選例中，所述的篩選標(biāo)記基因選自下組：gus(β-葡萄糖苷酸酶)基因、hyg(潮霉素)基因、neo(新霉素)基因、或gfp(綠色熒光蛋白)基因、DsRed（紅色熒光蛋白）基因。

在另一優(yōu)選例中，所述的外源Cre基因具有如SEQ?ID?NO.:2所示的核苷酸序列。

在本發(fā)明的第二方面，提供了一種基因表達(dá)盒，所述基因表達(dá)盒從5’至3’依次具有下述元件：啟動子元件、Cre基因的ORF?序列、和終止子序列，并且所述的啟動子元件是脂質(zhì)運(yùn)載蛋白5（Lipocalin5）的啟動子或其活性片段，所述啟動子具有驅(qū)動Cre基因在動物附睪頭部特異表達(dá)的功能。

在另一優(yōu)選例中，所述的基因表達(dá)盒還包括選自下組的一種或多種元件：poly(A)元件、增強(qiáng)子、轉(zhuǎn)運(yùn)元件、或基因靶向元件。

在本發(fā)明的第三方面，提供了一種載體，所述載體含有或第一方面所述的轉(zhuǎn)基因構(gòu)建物，或第二方面所述的基因表達(dá)盒。