[發明專利]一種高效基因槍轉化小麥葉片單細胞瞬間表達的方法及其應用

有效

• 申請號: 201210507031.7
• 申請日: 2012-12-03
• 公開（公告）號: CN102978230A
• 公開（公告）日: 2013-03-20
• 發明（設計）人: 邢莉萍;曹愛忠;錢晨;王秀娥;陳佩度
• 申請（專利權）人: 南京農業大學
• 主分類號: C12N15/63
• 分類號: C12N15/63;C12Q1/02;A01H5/00
• 代理公司: 南京天華專利代理有限責任公司 32218
• 代理人: 徐冬濤;傅婷婷

技術領域

本發明屬于生物技術領域，公開了一種高效基因槍轉化小麥葉片單細胞瞬間表達的方法及其應用。

背景技術

白粉病是小麥的主要真菌病害之一，培育抗病品種是目前最經濟有效的方法。常規育種周期長，轉基因生物技術育種是高效培育抗病小麥抗病新品種的有效策略。但小麥基因組龐大、組織培養周期長且轉基因頻率太低，限制了利用穩定轉化方法高通量、快速鑒定白粉病抗病候選基因及相關基因功能的研究，使得有效抗白粉病基因的發掘受阻。因此，建立快速而有效的鑒定白粉病抗病候選基因功能的技術體系顯得尤為重要。

單細胞瞬間表達技術可將外源基因導入植物細胞內在一定時間內（降解之前）可獲得瞬間超量表達，亦可將外源基因片段構建呈“發夾（hairpin）結構”導入植物細胞內瞬間表達后引起內源基因沉默（TIGS），同時在單細胞基礎上研究瞬間表達細胞內的外源基因表達改變對病原菌侵染的影響，分析外源基因的抗病功能。對抗病基因工程的上游已經篩選和克隆出的包括抗病基因類似物、轉錄因子、信號傳導因子及大量的抗病基因類似物片段等，利用單細胞瞬間表達技術這種高效而快速的功能驗證方法，來鑒定它們的功能，可以有效地推動其在分子育種中的研究和利用。利用單細胞瞬間表達技術在大麥中鑒定白粉病抗病基因的功能已經得到了廣泛的應用（Nelson?A?J,BushnellW?R.Transient?expression?of?anthocyanin?genes?inbarley?epidermal?cells:potential?for?use?in?evaluation?ofdisease?response?genes.Transgenic?Res，1997,6(3):233–244；Schultheiss?H,DechertC.A?small?GTP-bindinghost?proteins?required?for?entry?of?powdery?mildew?fungus?into?epidermal?cells?ofbarley.Plant?Physiol，2002,128(4):1447–1454）。

一個高效的小麥基因槍瞬間表達技術體系的包括三個要素：1、方便觀察和統計的報告基因；2、高效的基因槍轉化參數；3、適合的目標基因表達產物與白粉菌互作效率的統計參數。近幾年，單細胞瞬間表達技術在小麥中也有初步的應用（Schweizer,Pokorny?et?al.ATransient?Assay?System?for?the?Functional?Assessment?of?Defense-Related?Genes?in?Wheat.Molecular?Plant-MicrobeInteractions.1999,12:647-654），但是該技術在小麥中還存在基因槍轉化的效率受人為操作的主觀影響而效率較低、在小麥中缺乏高效的基因槍轉化參數的篩選、選用報告基因表達效率不穩定等一些問題。為了建立高效小麥單細胞瞬間表達體系，本發明緊扣上述三要素，以小麥離體葉片為受體，使用綠色熒光蛋白（GFP）基因作為報告基因，對表達效率影響較大的多個轉化參數進行優化，建立了適合小麥單細胞瞬間表達的技術體系，并利于該體系對簇毛麥Sgt1基因在小麥白粉病抗病中的功能研究，為下一步該基因在小麥抗白粉病轉基因育種中的利用提供依據。

發明內容

本發明的目的是針對現有技術的上述缺陷，對小麥離體葉片基因槍轉化方法進行了系統的研究，建立了高效的小麥單細胞瞬間表達體系。

本發明的另一目的是提供一種高頻小麥葉片瞬間表達體系分析外源基因的抗白粉病功能的方法。

本發明的又一目的是提供含有抗白粉病相關基因簇毛麥SGT1基因的表達載體。

本發明的又一目的是提供該表達載體在小麥抗白粉病轉基因育種中的應用。

本發明的目的可通過如下技術方案實現：

一種高效基因槍轉化小麥葉片單細胞的方法，使用綠色熒光蛋白GFP基因作為報告基因，以小麥第一葉的離體葉片為轉化受體進行基因槍轉化，小麥葉片采用固體保鮮培養基固定，基因槍轉化采用直徑為1μm的鎢粉，用量為300ug/槍，質粒DNA用量為750ng/槍，轟擊距離采用可裂膜氦壓為1350psi，可裂膜與受體膜距離為6mm，受體與阻擋網距離為6cm。

本發明所述高效基因槍轉化小麥葉片單細胞的方法在白粉病抗病基因篩選和/或功能鑒定中的應用。

一種利用本發明所述的高效基因槍轉化小麥葉片單細胞的方法分析外源基因的抗白粉病功能的方法，包括如下步驟：