[發(fā)明專利]臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分化為神經(jīng)干細(xì)胞的誘導(dǎo)方法

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210504988.6
• 申請(qǐng)日: 2012-11-30
• 公開（公告）號(hào): CN103031275A
• 公開（公告）日: 2013-04-10
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陸華
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 陸華
• 主分類號(hào): C12N5/0797
• 分類號(hào): C12N5/0797;C12N5/0775
• 代理公司: 常州市維益專利事務(wù)所 32211
• 代理人: 何學(xué)成

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種應(yīng)用全反式維甲酸聯(lián)合細(xì)胞因子誘導(dǎo)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分化為神經(jīng)干細(xì)胞的方法。

背景技術(shù)

目前，神經(jīng)干細(xì)胞主要從胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)或是直接從發(fā)育中和成年哺乳動(dòng)物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中分離培養(yǎng)獲得。但是倫理學(xué)、安全性問題以及細(xì)胞來源和數(shù)量的有限，在一定程度上限制了神經(jīng)干細(xì)胞的移植應(yīng)用。因此，很有必要尋找其它能夠獲得神經(jīng)干細(xì)胞的途徑來克服這些限制。中胚層來源的間充質(zhì)干細(xì)胞向外胚層來源的神經(jīng)干細(xì)胞轉(zhuǎn)化的研究正處于起步階段，臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(UC-MSCs)來自新生兒，取材方便、易于體外擴(kuò)增、安全無病毒感染風(fēng)險(xiǎn)以及不受倫理和法律限制等優(yōu)勢(shì)，表達(dá)胚胎干細(xì)胞特異性基因、端粒末端轉(zhuǎn)移酶SSEA4和TAR-1-60等原始干細(xì)胞表面標(biāo)志，如能將UC-MSCs誘導(dǎo)為神經(jīng)干細(xì)胞后應(yīng)用將規(guī)避上述不足之處。全反式維甲酸是維生素A的衍生物，能夠明顯增加神經(jīng)細(xì)胞的數(shù)量并呈劑量依賴效應(yīng)，能調(diào)節(jié)表皮生長(zhǎng)因子(EGF)反應(yīng)的神經(jīng)干細(xì)胞分化，增加神經(jīng)元細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞的合成。將其與神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子和細(xì)胞因子聯(lián)合用于誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞向神經(jīng)干細(xì)胞方向分化，同體內(nèi)發(fā)育過程相似，且可以部分模擬體內(nèi)環(huán)境，可以誘導(dǎo)UC-MSCs轉(zhuǎn)化為神經(jīng)干細(xì)胞，使其有可能成為今后臨床應(yīng)用更為理想的種子細(xì)胞。

發(fā)明內(nèi)容

為使UC-MSCs有效轉(zhuǎn)化為神經(jīng)干細(xì)胞，本發(fā)明提供一種應(yīng)用全反式維甲酸(ATRA)聯(lián)合堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)、表皮生長(zhǎng)因子(EGF)誘導(dǎo)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(UC-MSCs)分化為神經(jīng)干細(xì)胞的方法，UC-MSCs經(jīng)誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化為神經(jīng)干細(xì)胞，經(jīng)分裂增殖多次傳代后仍然保持較強(qiáng)的活力，實(shí)現(xiàn)了間充質(zhì)細(xì)胞跨胚層分化為非間充質(zhì)細(xì)胞的能力。

具體的，本發(fā)明的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分化為神經(jīng)干細(xì)胞的誘導(dǎo)方法包括如下步驟：UC-MSCs的分離、原代培養(yǎng)，UC-MSCs的傳代培養(yǎng)與擴(kuò)增，UC-MSCs體外誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化為神經(jīng)干細(xì)胞，神經(jīng)干細(xì)胞的分化培養(yǎng)以及免疫熒光法檢測(cè)。

其中，所述的UC-MSCs的分離、原代培養(yǎng)的步驟包括：無菌條件下，將健康胎兒的臍帶用含有雙抗和兩性霉素的D-Hanks液充分沖洗，沖去臍靜脈及動(dòng)脈內(nèi)的殘存積血；撕掉臍帶表面的羊膜得到間充質(zhì)組織，用組織剪將臍帶組織剪碎成1mm³大小的組織塊，將組織塊移至內(nèi)含一磁力攪拌子的玻璃瓶中，加入膠原酶37℃下持續(xù)磁力攪拌消化30分鐘；向膠原酶-組織塊消化體系內(nèi)加入終濃度為0.125％的胰酶，在37℃環(huán)境中繼續(xù)磁力攪拌消化30分鐘后，加入10％體積的FBS終止消化；將收集的細(xì)胞用PBS吹打成均勻懸液，1500轉(zhuǎn)/分鐘旋轉(zhuǎn)15分鐘洗滌后收集細(xì)胞；用含20％FBS，4ng/ml表皮生長(zhǎng)因子(EGF)的DMEM/F12完全培養(yǎng)液重懸消化分離所得細(xì)胞，吹打均勻，計(jì)數(shù)細(xì)胞；調(diào)整細(xì)胞濃度為1.0×10⁶細(xì)胞/ml，接種于包被后的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置于37℃，5％CO₂，飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；培養(yǎng)4-5天后全量換液，棄去未貼壁細(xì)胞，以后每3-4天半量換液一次；細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)至80-90％匯合時(shí)，以0.25％胰蛋白酶-0.01％EDTA消化，得到原代細(xì)胞。

所述UC-MSCs的傳代培養(yǎng)與擴(kuò)增步驟包括：觀察原代培養(yǎng)細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)至80-90％匯合時(shí)，吸棄培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)原有培養(yǎng)液，吸取PBS緩沖液加入培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)洗滌，棄去洗液；加入胰蛋白酶-EDTA消化液，浸漫覆蓋瓶底；加入FBS中止胰酶消化；加入PBS反復(fù)吹打沖洗，在室溫下900轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘；棄去上清液，加入DMEM/F12重懸細(xì)胞，按1∶2-1∶3比例在細(xì)胞培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)，計(jì)為第1代UC-MSC；待細(xì)胞生長(zhǎng)至80-90％匯合時(shí)，重復(fù)上述操作進(jìn)行多代細(xì)胞培養(yǎng)擴(kuò)增。

所述UC-MSCs體外誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化為神經(jīng)干細(xì)胞步驟包括：取2-3代培養(yǎng)細(xì)胞，分別接種于6孔板，生長(zhǎng)密度達(dá)到60％時(shí)，換成全反式維甲酸聯(lián)合細(xì)胞因子的誘導(dǎo)培養(yǎng)基，在37℃、5％CO₂、飽和濕度靜置培養(yǎng)；待培養(yǎng)出現(xiàn)大量懸浮克隆球后進(jìn)行傳代培養(yǎng)；無菌條件下，在倒置顯微鏡下用玻璃微針將其中的大于200μm的大克隆球切成數(shù)塊，繼續(xù)培養(yǎng)；7～10天傳代1次；傳代后的細(xì)胞再無血清誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)體系中繼續(xù)培養(yǎng)。

所述神經(jīng)干細(xì)胞的分化培養(yǎng)步驟包括：將以上獲得的、來自單細(xì)胞的克隆球經(jīng)胰酶消化后，種植于預(yù)先用多聚賴氨酸包被的小培養(yǎng)皿中，用DMEM/F12+5％Fcs+EGF+bFGF培養(yǎng)基和經(jīng)過濾滅菌后的新鮮成人腦脊液中進(jìn)行分化培養(yǎng)。