[發明專利]臍帶間充質干細胞分化為神經干細胞的誘導方法

無效

• 申請號: 201210504988.6
• 申請日: 2012-11-30
• 公開（公告）號: CN103031275A
• 公開（公告）日: 2013-04-10
• 發明（設計）人: 陸華
• 申請（專利權）人: 陸華
• 主分類號: C12N5/0797
• 分類號: C12N5/0797;C12N5/0775
• 代理公司: 常州市維益專利事務所 32211
• 代理人: 何學成

1.一種臍帶間充質干細胞分化為神經干細胞的誘導方法，其特征在于應用全反式維甲酸和細胞因子誘導臍帶間充質干細胞分化為神經干細胞，所述誘導方法包括如下步驟：UC-MSCs的分離、原代培養，UC-MSCs的傳代培養與擴增，UC-MSCs體外誘導轉化為神經干細胞，神經干細胞的分化培養以及免疫熒光法檢測；其中，

所述的UC-MSCs的分離、原代培養的步驟包括：無菌條件下，將健康胎兒的臍帶用含有雙抗和兩性霉素的D-Hanks液充分沖洗，沖去臍靜脈及動脈內的殘存積血；撕掉臍帶表面的羊膜得到間充質組織，用組織剪將臍帶組織剪碎成1mm³大小的組織塊，將組織塊移至內含一磁力攪拌子的玻璃瓶中，加入膠原酶37℃下持續磁力攪拌消化30分鐘；向膠原酶-組織塊消化體系內加入終濃度為0.125％的胰酶，在37℃環境中繼續磁力攪拌消化30分鐘后，加入10％體積的FBS終止消化；將收集的細胞用PBS吹打成均勻懸液，1500轉/分鐘旋轉15分鐘洗滌后收集細胞；用含20％FBS，4ng/ml表皮生長因子(EGF)的DMEM/F12完全培養液重懸消化分離所得細胞，吹打均勻，計數細胞；調整細胞濃度為1.0×10⁶細胞/ml，接種于包被后的細胞培養瓶中，置于37℃，5％CO₂，飽和濕度的細胞培養箱中培養；培養4-5天后全量換液，棄去未貼壁細胞，以后每3-4天半量換液一次；細胞貼壁生長至80-90％匯合時，以0.25％胰蛋白酶-0.01％EDTA消化，得到原代細胞；

所述的UC-MSCs的傳代培養與擴增步驟包括：觀察原代培養細胞貼壁生長至80-90％匯合時，吸棄培養瓶內原有培養液，吸取PBS緩沖液加入培養瓶內洗滌，棄去洗液；加入胰蛋白酶-EDTA消化液，浸漫覆蓋瓶底；加入FBS中止胰酶消化；加入PBS反復吹打沖洗，在室溫下900轉/分鐘離心10分鐘；棄去上清液，加入DMEM/F12重懸細胞，按1∶2-1∶3比例在細胞培養箱中傳代培養，計為第1代UC-MSC；待細胞生長至80-90％匯合時，重復上述操作進行多代細胞培養擴增；

所述的UC-MSCs體外誘導轉化為神經干細胞步驟包括：取2-3代培養細胞，分別接種于6孔板，生長密度達到60％時，換成全反式維甲酸聯合細胞因子的誘導培養基，在37℃、5％CO₂、飽和濕度靜置培養；待培養出現大量懸浮克隆球后進行傳代培養；無菌條件下，在倒置顯微鏡下用玻璃微針將其中的大于200μm的大克隆球切成數塊，繼續培養；7～10天傳代1次；傳代后的細胞再無血清誘導培養基培養體系中繼續培養；

所述的神經干細胞的分化培養步驟包括：將以上獲得的、來自單細胞的克隆球經胰酶消化后，種植于預先用多聚賴氨酸包被的小培養皿中，用DMEM/F12+5％Fcs+EGF+bFGF培養基和經過濾滅菌后的新鮮成人腦脊液中進行分化培養；以及

所述的免疫熒光法檢測步驟包括：將上述獲得的克隆球種入包被的小培養皿中，用無血清培養基貼壁培養12小時后行熒光檢測；經分化培養后的細胞分別于2、7、14和21天行熒光檢測。

2.如權利要求1所述的臍帶間充質干細胞分化為神經干細胞的誘導方法，其特征在于，所述的UC-MSCs的傳代培養與擴增步驟中，所述的傳代培養體系為20％FBS，4ng/ml表皮生長因子(EGF)的DMEM/F12完全培養液。

3.如權利要求1所述的臍帶間充質干細胞分化為神經干細胞的誘導方法，其特征在于，所述的UC-MSCs體外誘導轉化為神經干細胞步驟中，所述的誘導培養基為DMEM+10％FBS+1μmol/L?ATRA+20ng/mlbFGF+20ng/ml?EGF。