[發明專利]一種檢測細胞內硫化氫的熒光探針及其制備方法和應用

有效

• 申請號: 201210504410.0
• 申請日: 2012-11-30
• 公開（公告）號: CN103160274A
• 公開（公告）日: 2013-06-19
• 發明（設計）人: 唐波;王栩;孫娟;馬曉旭;呂建政
• 申請（專利權）人: 山東師范大學
• 主分類號: C09K11/06
• 分類號: C09K11/06;C07D209/12;G01N21/64
• 代理公司: 濟南圣達知識產權代理有限公司 37221
• 代理人: 楊琪

技術領域：

本發明涉及一種熒光探針，特別涉及一種花菁類染料熒光探針、其合成方法及其在檢測細胞內硫化氫的應用，屬于檢測技術領域。?

背景技術：

長久以來，硫化氫(hydrogen?sulfide，H₂S)這一具有臭雞蛋氣味的氣體，多年來，人們一直認為H₂S僅是一種有毒氣體，人們對于它的研究僅限于其毒性作用。20世紀90年代中期，人們發現機體可以內源性產生H₂S氣體，它在體內主要由胱硫醚-β-合成酶(cystathionine-β-synthase，CBS)、胱硫醚-γ一裂解酶(cystathionine-γ-lyase，CSE)，催化L-半胱氨酸產生H₂S。CSE基因在主動脈、肺動脈、腸系膜動脈、尾動脈和門靜脈中均有表達，而CBS基因主要表達于中樞神經系統中。H₂S具有調節神經、心血管和消化系統功能的作用，參與肺動脈高壓、動脈硬化、內毒素休克、出血性休克及心肌缺血性受損等的病理生理過程，被認為是繼一氧化氮(NO)和一氧化碳(CO)之后的一種新的氣體信號分子。內源性氣體信號分子因其具有持續產生、傳播迅速等特點。目前的硫化氫檢測技術，如比色法，電化學法，氣相色譜法，和金屬誘導的硫化物沉淀，往往需要延后處理或破壞的組織或產生細胞裂解物。?

近年用于檢測體內硫化氫的熒光探針，比較少見。如熒光素為母體(Hanjing?Peng,YunfengCheng,Chaofeng?Dai,Adrienne?L.King,Benjamin?L.Predmore,David?J.Lefer,and?Binghe?Wang,Angew.Chem.Int.Ed.2011,50,9672-9675)的探針，選擇性好，檢測前后熒光增強到原來的55-70倍，但是此探針反應時間長（1h），激發波長在可見光區（488nm）；以BODOPY為母體和(Yong?Qian,Jason?Karpus,Omer?Kabil,Shu-Yu?Zhang,Hai-Liang?Zhu,Ruma?Banerjee,JingZhao,Chuan?He,Nature?Communications.2011,2,495）以羅丹明為母體的（AlexanderR.Lippert,Elizabeth?J.New，and?Christopher?J.Chang，J.Am.Chem.Soc.,2011,133:10078-10080）熒光探針，雖然選擇性好，但是反應時間長（20min或1h）；部分檢測硫化氫的熒光探針因為波長短，溶解性差等因素不能用于活體內，如(Hanjing?Peng,Yunfeng?Cheng,Chaofeng?Dai,Adrienne?L.King,Benjamin?L.Predmore,David?J.Lefer,and?Binghe?Wang,Angew.Chem.Int.Ed.2011,50,9672-9675)，此探針雖是個快速反應，但是所選的丹酰為母體，激發為340nm，波長短，如果用于活體會造成損傷。總的來說以上熒光探針一般水溶性不好，而且激發發射波長多處于紫外可見光區，從而限制了它們在生物體內的應用。這就需要研制一種熒光波長長的，水溶性好的熒光探針。而花菁類熒光探針發射波長在近紅外區，不易被生物介質基質吸收，對組織損傷小且穿透力強，能很好的用于活體。?

發明內容：

本發明的目的在于克服目前硫化氫檢測熒光探針的不足，提供一種檢測細胞內硫化氫的熒光探針及其制備方法和應用，該類熒光探針結構新穎、靈敏度、選擇性好、光穩定性好。?

本發明采取的技術方案為：?

一種檢測細胞內硫化氫的熒光探針，其結構式如下：?

所述的檢測細胞內硫化氫的熒光探針的制備方法，包括步驟如下：?

（1）將Cy7熒光染料即2-[4-氯-7-（1-乙基-3（二氫吲哚-2-亞基）-2,3-二甲基]-3,5-（丙烷-1,3-二基）-1,3,5-庚三烯-1-基）-1-乙基-3,3-二甲基-3H-吲哚鎓、乙酸鈉溶解在無水DMF中，在Ar氣保護下加熱回流2-4h，得到的混合物冷卻后抽濾，母液低溫（-4～20℃）結晶，抽濾得酮式花菁紅棕色晶體；?

（2）將鄰甲酰基苯甲酸、草酰氯溶解在無水CH₂Cl₂中然后加入少量DMF，在0℃攪拌2-6h，得鄰甲酰基苯甲酰氯；?