[發明專利]采用標簽蛋白人源化嵌合抗體作為陽性對照物的間接免疫檢測方法及試劑盒

有效

• 申請號: 201210500268.2
• 申請日: 2012-11-29
• 公開（公告）號: CN102981002A
• 公開（公告）日: 2013-03-20
• 發明（設計）人: 任超;李全;焦守恕
• 申請（專利權）人: 同昕生物技術（北京）有限公司
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/577;G01N33/543
• 代理公司: 北京海虹嘉誠知識產權代理有限公司 11129
• 代理人: 張濤

技術領域

本發明涉及診斷試劑的制備，特別是以標簽蛋白人源化嵌合抗體作為通用診斷試劑的陽性對照的應用。

背景技術

應用間接法免疫技術，如間接酶聯免疫法、化學發光法等測定樣品中抗體的濃度是常用的檢測方法，該方法的原理是在固相載體上包被抗原蛋白，加入待測樣品，待測樣品中的抗體與包被抗原反應，再加入酶標記的二抗，即可檢測樣品中是否有與抗原結合的抗體。在此類試驗中，必須設立陽性對照孔，陽性對照多用臨床病人的血清或其他形式的人血清。但人源性血制品，很可能含有致病性傳染物質，對操作者存在潛在的威脅，同時在配制陽性對照過程中需要大量血清或血漿，而有些病的血清或血漿又比較難得到。因此應用人源血液作為陽性對照，對于制備大量檢測試劑盒產品而言，原料受到客觀的限制。所以尋求一種陽性對照替代品，應用于間接法檢測抗體類的試劑盒成為大家共同的意愿。

蛋白標簽的用途，截至目前，主要是用于對表達蛋白進行鑒定與純化。即通過基因工程的方式，在目標蛋白上加上標簽序列，在表達純化出的蛋白上就會帶上標簽蛋白序列，常用的標簽蛋白有Flag、His、GST、GFP、myc、HA等，其中HIS和GST是最常用的純化標簽分子。

His標簽是由6個組氨酸(His-His-His-His-His-His)組成的短肽,專門設計用于重組蛋白質的吸附純化。其分子量較小，并且較容易分離和純化，His融合標簽與其它標簽相比有很多明顯優勢，是目前用于純化的融合標簽中使用最為廣泛的一種。利用His標簽可以建立基于融合蛋白的高效檢測和純化系統。而His抗體一般用于檢測和His標簽融合表達蛋白的表達、細胞內定位，以及純化、定性或定量檢測His融合表達蛋白等。

GST標簽體系具有蛋白表達產率高、表達產物純化方便，以及利于GST抗體制備等特點。GST融合蛋白在水溶液中可溶，可從細菌裂解液中提取，在不變性的條件下通過親和層析得到。GST融合蛋白可被位點特異性蛋白酶裂解從而除去GST蛋白。融合蛋白也是一個非常好的強免疫原，因此，很容易制備抗新蛋白的抗體。正是由于以上的優點，商品化的GST融合蛋白表達體系以及GST標簽抗體系統至今仍被廣泛應用。

如上所述，由于標簽蛋白在蛋白表達及純化中的巨大作用，標簽蛋白被廣泛的應用在診斷試劑中，如用于肝炎類、艾滋、梅毒等常見重要傳染病及部分癌癥疾病的診斷抗原都帶有His標簽或GST標簽。

人源化抗體是指抗體的恒定區部分（即CH和CL區）或全部由人類抗體基因所編碼。由于人源化抗體可以大大減少異源抗體對人類機體造成的免疫副反應，因此目前主要用作治療性抗體。是利用DNA重組技術，將異源（動物源）單抗的輕、重鏈可變區基因插入含有人抗體恒定區的表達載體中，轉化哺乳動物細胞表達出嵌合抗體，這樣表達的抗體分子中輕重鏈的可變區V區是異源的，而恒定區C區是人源的，整個抗體分子中近2/3部分都是人源的。將標簽蛋白人源化嵌合抗體用作間接免疫檢測反應的陽性對照物，到目前未見到報道。而以下本發明將其用作間接免疫檢測反應的陽性對照物，并提供相應的反應檢測試劑盒，并通過對比試驗證明這一新的用途所帶來的積極意義和優越效果。

發明內容

本發明提供了標簽蛋白人源化嵌合抗體的一種新用途，以及由此產生的免疫檢測試劑盒。本發明的技術方案如下：

一種采用標簽蛋白人源化嵌合抗體作為陽性對照物的間接免疫檢測方法，其步驟如下：

（1）針對要檢測的靶標抗體，制備用于反應的包被有重組目標抗原的固相載體，

（2）制備陽性對照，

（3）在所述固相載體上進行間接免疫檢測反應；

其特征在于：所述重組目標抗原指人工重組的帶標簽蛋白的目標抗原物，所述重組目標抗原中的目標抗原指能與所述靶標抗體特異性結合的抗原物；

所述陽性對照物采用抗重組目標抗原中的標簽蛋白的人源化嵌合抗體，

所述人源化嵌合抗體是指抗體Fc端由人的抗體基因編碼，抗體Fab端則由小鼠抗體的基因編碼，即將標簽蛋白的單克隆抗體的輕、重鏈可變區基因插入到含有人源抗體恒定區基因的表達載體中，轉入動物細胞中表達得到的標簽蛋白的人源化嵌合抗體。

所述標簽蛋白的單克隆抗體指Flag、His、GST、GFP、myc或HA的單克隆抗體。

所述標簽蛋白人源化嵌合抗體指His人源化嵌合抗體或GST人源化嵌合抗體。

所述陽性對照物溶于陽性對照稀釋液中。

還包括用于承載檢測反應的固相載體和陽性對照物，其特征在于：

所述固相載體上包被有重組目標抗原，