[發(fā)明專利]鷹嘴豆種子中蛋白類型α‐淀粉酶抑制劑的提取分離方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210500059.8
• 申請(qǐng)日: 2012-11-29
• 公開（公告）號(hào): CN102924592A
• 公開（公告）日: 2013-02-13
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 麻浩;王占奎;顧愛星;葛杰;馬洪雨;苑煒
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C07K14/81
• 分類號(hào): C07K14/81;C07K1/36;C07K1/30;C07K1/20;C07K1/18
• 代理公司: 南京天華專利代理有限責(zé)任公司 32218
• 代理人: 徐冬濤;傅婷婷

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于食品科學(xué)生物活性成分分離純化領(lǐng)域，涉及一種鷹嘴豆種子中蛋白類型α-淀粉酶抑制劑的提取分離方法，具體涉及一種以鷹嘴豆成熟種子為材料，經(jīng)提取液浸提-適溫加熱-硫酸銨分級(jí)沉淀-離子交換色譜-高效液相反相色譜對(duì)鷹嘴豆種子中所含蛋白類型α-淀粉酶抑制劑進(jìn)行分離純化的新方法。?

背景技術(shù)

α-淀粉酶抑制劑可有效地抑制人腸道內(nèi)唾液中α-淀粉酶及胰淀粉酶的活性，阻礙食物中碳水化合物的水解和消化，降低人體糖分吸收以及血糖和血脂的含量，減少脂肪合成，減輕體重，這在醫(yī)藥和保健食品行業(yè)上，可用于開發(fā)糖尿病人專用食品，減肥藥，食品添加劑等；同時(shí)由于α-淀粉酶抑制劑對(duì)哺乳動(dòng)物、昆蟲以及微生物的α-淀粉酶有很強(qiáng)的特異性抑制作用，其殺蟲機(jī)理在于能抑制昆蟲消化道內(nèi)α-淀粉酶的活性，使昆蟲食入的淀粉不能水解消化，從而阻斷了昆蟲的主要能量來源；而且α-淀粉酶抑制劑和昆蟲淀粉消化酶結(jié)合形成EI復(fù)合物，也會(huì)刺激昆蟲的消化腺過量分泌消化酶，通過神經(jīng)系統(tǒng)的反饋，使昆蟲產(chǎn)生厭食反應(yīng)，導(dǎo)致發(fā)育不良或死亡，這在生物農(nóng)藥上，可為設(shè)計(jì)新型無毒無污染抗蟲、抗菌藥物，減少環(huán)境污染等提供良好的實(shí)驗(yàn)材料，在作物品質(zhì)育種方面，可為轉(zhuǎn)基因抗病蟲農(nóng)作物新品種的培育提供基因源，既具有重要的理論意義，又具有廣闊的應(yīng)用前景。?

鷹嘴豆(Cicer?arietinum)是世界上第三大豆科作物，極度耐旱耐瘠薄，主要種植在干旱和半干旱地區(qū)，在我國新疆已有2500年的種植歷史，是我國維吾爾族人民喜愛的一種副食品，也是新疆維吾爾族人民常用藥材，在新疆農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、人民生活和生態(tài)環(huán)境保護(hù)中有著重要作用。近年來鷹嘴豆種子中許多活性成分已引起國內(nèi)外研究者的廣泛重視和興趣。因此，研究和開發(fā)鷹嘴豆籽粒中所含的蛋白質(zhì)類α-淀粉酶抑制劑，這不僅可為鷹嘴豆的開發(fā)利用提供思路，促進(jìn)新疆鷹嘴豆的生產(chǎn)，進(jìn)一步發(fā)揮其在解決新疆土壤干旱、退化、沙化等問題中不可替代的作用；同時(shí)還可為其蛋白質(zhì)類α-淀粉酶抑制劑在醫(yī)藥和保健食品行業(yè)、生物制藥、生物農(nóng)藥開發(fā)以及作物抗病蟲基因工程育種等方面應(yīng)用提供理論和基因基礎(chǔ)。?

由于鷹嘴豆種子蛋白含量豐富，從眾多的種子蛋白中分離得到具有α-淀粉酶抑制劑活性的蛋白物質(zhì)具有很大的難度，各項(xiàng)純化技術(shù)過程的選擇和優(yōu)化條件需要合理選擇和合理的參數(shù)?設(shè)置。以新疆鷹嘴豆種子為材料，建立適用于鷹嘴豆種子中蛋白類型α-淀粉酶抑制劑的分離純化技術(shù)，可為開發(fā)利用鷹嘴豆重要種質(zhì)資源和優(yōu)良保健成分提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和參考。?

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，提供一種鷹嘴豆種子中蛋白類型α-淀粉酶抑制劑的提取分離方法。?

本發(fā)明的目的可通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：?

一種適宜于鷹嘴豆種子中蛋白類型α-淀粉酶抑制劑的提取分離方法，包含如下步驟：?

（1）采用成熟收獲的鷹嘴豆種子，曬干，磨碎的豆粉；?

（2）制備的豆粉，按5mL蛋白提取液：1g豆粉比例加入預(yù)冷的蛋白提取液，4℃充分?jǐn)嚢杌旌?h；蛋白提取液為pH=8.0，且含有500mmol/L?NaCl、2mmol/L?PMSF、1％β-巰基乙醇和10mmol/L?EDTA-Na₂的10mmol/L的Tris-HCl緩沖液；?

（3）混合物于12000×g，4℃下離心10min，取上清液；?

（4）上清液70℃水浴5min，期間不斷搖動(dòng)使液體受熱均勻，于12000×g，4℃下離心10min，取上清液，即為α-淀粉酶抑制劑的粗提液；?

（5）將α-淀粉酶抑制劑粗提液進(jìn)行硫酸銨分級(jí)沉淀，收集各級(jí)沉淀物；?

（6）分別取具有較高α-淀粉酶抑制活性的硫酸銨飽和度60％-80％和80％-100％的分級(jí)沉淀透析除鹽，透析結(jié)束后冷凍干燥；?

（7）對(duì)兩種透析除鹽后的硫酸銨分級(jí)蛋白沉淀，分別利用離子交換色譜進(jìn)行蛋白純化分離，收集具有α-淀粉酶抑制活性的蛋白進(jìn)行透析除鹽，并在冷凍干燥機(jī)上冷凍干燥。?

所述的離子交換色譜條件如下：?

①液相色譜儀采用AKTA?prime蛋白純化系統(tǒng)，離子交換柱為HiPrep16/10Q?XL；?

②緩沖液A為20mmol/L的Tris-HCl，pH=8.0，緩沖液B為1.0mol/L的NaCl；?

③用Tris-HCl（20mmol/L，pH=8.0）溶解蛋白粉末，蛋白濃度為40mg/mL，上樣體積為2mL，緩沖液流速為3mL/min，洗脫體積為200mL；?