[發(fā)明專利]鷹嘴豆種子中蛋白類型α‐淀粉酶抑制劑的提取分離方法有效
| 申請?zhí)枺?/td> | 201210500059.8 | 申請日： | 2012-11-29 |
| 公開（公告）號(hào)： | CN102924592A | 公開（公告）日： | 2013-02-13 |
| 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人： | 麻浩;王占奎;顧愛星;葛杰;馬洪雨;苑煒 | 申請（專利權(quán)）人： | 南京農(nóng)業(yè)大學(xué) |
| 主分類號(hào)： | C07K14/81 | 分類號(hào)： | C07K14/81;C07K1/36;C07K1/30;C07K1/20;C07K1/18 |
| 代理公司： | 南京天華專利代理有限責(zé)任公司 32218 | 代理人： | 徐冬濤;傅婷婷 |
| 地址： | 210095 *** | 國省代碼： | 江蘇;32 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 鷹嘴豆 種子 蛋白 類型 淀粉酶 抑制劑 提取 分離 方法 | ||
1.一種適宜于鷹嘴豆種子中蛋白類型α-淀粉酶抑制劑的提取分離方法，其特征在于包含如下步驟：?
（1）采用成熟收獲的鷹嘴豆種子，曬干，磨碎成豆粉；?
（2）制備的豆粉，按5mL蛋白提取液：1g豆粉比例加入預(yù)冷的蛋白提取液，4℃充分?jǐn)嚢杌旌?h；蛋白提取液為pH=8.0，且含有500mmol/L?NaCl、2mmol/L?PMSF、1％β-巰基乙醇和10mmol/L?EDTA-Na2的10mmol/L的Tris-HCl緩沖液；?
（3）混合物于12000×g，4℃下離心10min，取上清液；?
（4）上清液70℃水浴5min，期間不斷搖動(dòng)使液體受熱均勻，于12000×g，4℃下離心10min，取上清液，即為α-淀粉酶抑制劑的粗提液；?
（5）將α-淀粉酶抑制劑粗提液進(jìn)行硫酸銨分級(jí)沉淀，收集各級(jí)沉淀物；?
（6）分別取具有較高α-淀粉酶抑制活性的硫酸銨飽和度60％-80％和80％-100％的分級(jí)蛋白沉淀透析除鹽，透析結(jié)束后冷凍干燥；?
（7）對上述兩種透析除鹽后的硫酸銨分級(jí)蛋白沉淀，分別利用離子交換色譜進(jìn)行蛋白純化分離，收集具有α-淀粉酶抑制活性的蛋白進(jìn)行透析除鹽，并在冷凍干燥機(jī)上冷凍干燥。?
所述的離子交換色譜條件如下：?
①液相色譜儀采用AKTA?prime蛋白純化系統(tǒng)，離子交換柱為HiPrep16/10QXL；?
②緩沖液A為20mmol/L的Tris-HCl，pH=8.0，緩沖液B為1.0mol/L的NaCl；?
③用20mmol/L，pH=8.0Tris-HCl溶解蛋白粉末，蛋白濃度為40mg/mL，上樣體積為2mL，緩沖液流速為3mL/min，洗脫體積為200mL；?
④洗脫方式采用梯度洗脫；?
（8）硫酸銨飽和度60％-80％分級(jí)蛋白沉淀上樣活性峰出峰時(shí)間為37min，硫酸銨飽和度80％-100％分級(jí)蛋白沉淀上樣活性峰出峰時(shí)間也為37min。對上一步得到的兩種具有α-淀粉酶抑制活性的蛋白，分別進(jìn)一步采用高效反相液相色譜法進(jìn)行蛋白純化分離，收集具有α-淀粉酶抑制活性的蛋白成分真空冷凍干燥，即制備得到兩種蛋白類型α-淀粉酶抑制劑凍干粉。?
所述的高效反相液相色譜條件如下：?
①液相色譜儀采用AKTA?purifier液相系統(tǒng)；?
②緩沖液A為含0.05％?TFA的超純水，緩沖液B為含0.05％?TFA的乙腈；?
③用超純水溶解蛋白粉末，蛋白濃度為5mg/mL，上樣體積為100μL，緩沖液流速為1.0mL/min，洗脫梯度乙腈濃度為5％-100％；?
④洗脫方式采用梯度洗脫。?
（9）從硫酸銨飽和度80％-100％分級(jí)蛋白沉淀分離得到的具有α-淀粉酶抑制活性的蛋白濃縮后經(jīng)SDS-PAGE電泳，測得其分子量約為25.0kDa，此SDS-PAGE電泳蛋白條帶經(jīng)基質(zhì)輔助激光解析串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（MALDI?TOF-TOF）鑒定，并根據(jù)獲得的肽段信息，經(jīng)網(wǎng)上搜索比對NCBI數(shù)據(jù)庫，確定該純化所得蛋白為一種鷹嘴豆清蛋白，具植物凝集素作用，其在NCBI中基因序列號(hào)為gi|339961380；從硫酸銨飽和度60％-80％分級(jí)蛋白沉淀分離得到的具有α-淀粉酶抑制活性的蛋白濃縮后經(jīng)SDS-PAGE電泳，測得其分子量約為60kDa，此SDS-PAGE電泳蛋白條帶經(jīng)LC-MS/MS鑒定，并根據(jù)獲得的肽段信息，經(jīng)網(wǎng)上搜索比對NCBI數(shù)據(jù)庫，確定此蛋白為一種鷹嘴豆球蛋白，其在NCBI中基因序列號(hào)為gi|75266099。?
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的適宜于鷹嘴豆種子中蛋白類型α-淀粉酶抑制劑的提取分離方法，其特征在于步驟（1）所述的豆粉需磨碎至能過60目篩。?
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