[發明專利]油藏中芽孢桿菌（Bacillus）的快速檢測方法

有效

• 申請號: 201210499739.2
• 申請日: 2012-11-30
• 公開（公告）號: CN102936630A
• 公開（公告）日: 2013-02-20
• 發明（設計）人: 張凡;佘躍惠;侯讀杰;柴陸軍
• 申請（專利權）人: 中國地質大學（北京）
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/64;C12Q1/04
• 代理公司: 北京鼎佳達知識產權代理事務所(普通合伙) 11348
• 代理人: 蔣常雪

1.?一種油藏中芽孢桿菌（Bacillus）的快速檢測方法，其特征在于，所述方法包括下列步驟：

（1）油藏樣品的采集；

（2）通過高溫滅活樣品中除能形成芽孢的菌以外的其它微生物；

（3）收集滅活后樣品中的芽孢；

（4）將收集的芽孢接種于培養基、在油藏原位溫度條件下對芽孢菌進行復活培養；

（5）通過分子生物學方法檢測復活的芽孢菌菌群。

2.如權利要求1所述的油藏中芽孢桿菌（Bacillus）的快速檢測方法，其特征在于，所述油藏為不同地質條件、不同開采方法的各類油藏。

3.如權利要求2所述的油藏中芽孢桿菌（Bacillus）的快速檢測方法，其特征在于，油藏樣品包括：注水井井口樣品，油井井口樣品，地層水樣品，油井返排樣品以及巖芯樣品。

4.如權利要求3所述的油藏中芽孢桿菌（Bacillus）的快速檢測方法，其特征在于，油藏樣品的采集步驟為將采集的油藏樣品裝入已滅菌的樣品瓶中，裝滿樣品瓶，密封，記錄樣品采集的油藏原位溫度。

5.如權利要求4所述的油藏中芽孢桿菌（Bacillus）的快速檢測方法，其特征在于，通過高溫滅活樣品中除能形成芽孢的菌以外的其它微生物步驟為，在無菌條件下取500ml?的油藏樣品到無菌燒瓶中，燒瓶口覆蓋上有透氣孔的無菌微生物培養膜；將燒瓶加熱，保持沸騰10分鐘，室溫冷卻。

6.如權利要求5所述的油藏中芽孢桿菌（Bacillus）的快速檢測方法，其特征在于，收集滅活后樣品中的芽孢步驟具體操作為：待燒瓶中樣品冷卻后，在無菌條件下將燒瓶中的樣品轉移到多個50ml的無菌離心管中，10000g離心力離心15分鐘，在無菌條件下將上清液轉移到一個干凈的無菌容器中保存為待用上清液；

然后在每個離心管中加入1ml的無菌水、重懸浮離心管底部收集到的沉淀物，將所有離心管中的重懸浮液收集到一起成為10ml的混合液；混合液中包含有芽孢。

7.如權利要求6所述的油藏中芽孢桿菌（Bacillus）的快速檢測方法，其特征在于，將收集的芽孢接種于培養基、在油藏原位溫度條件下對芽孢菌進行復活培養步驟具體為：將收集到的10ml的混合液作為種子，在無菌條件下接種到裝有30ml培養基的100ml培養瓶中，密封瓶口，在樣品采集的油藏原位溫度10℃-110℃條件下，搖菌（150rmp）對芽孢菌進行復活培養7-15天，得復活培養液；

所述的培養基是指與微生物原來生長環境相匹配，并能為芽孢復活提供營養物的培養基，培養基成分為：糖蜜2g，（NH4）2HPO4?0.16g，KNO3?0.2g，用待用上清液配制并定容到100ml，加入原油?2g；121℃滅菌20分鐘高壓蒸汽滅菌，原油來自樣品采集油藏。

8.如權利要求7所述的油藏中芽孢桿菌（Bacillus）的快速檢測方法，其特征在于，通過分子生物學方法檢測復活的芽孢菌菌群步驟具體操作為：在無菌條件下吸取5ml復活培養液于離心管中，10000g離心力離心10分鐘，移除上清，在離心管中加入1ml無菌水，重懸浮離心管底沉淀；

通過DNA試劑盒FastDNA?Spin?Kit?for?Soil來抽提重懸浮液中的DNA，構建16S?rDNA克隆文庫，基因測序以及微生物系統發育分析來完成對芽孢桿菌的檢測和分析。