[發(fā)明專利]油藏中芽孢桿菌（Bacillus）的快速檢測方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210499739.2
• 申請日: 2012-11-30
• 公開（公告）號: CN102936630A
• 公開（公告）日: 2013-02-20
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張凡;佘躍惠;侯讀杰;柴陸軍
• 申請（專利權(quán)）人: 中國地質(zhì)大學(xué)（北京）
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/64;C12Q1/04
• 代理公司: 北京鼎佳達(dá)知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11348
• 代理人: 蔣常雪

1.?一種油藏中芽孢桿菌（Bacillus）的快速檢測方法，其特征在于，所述方法包括下列步驟：

（1）油藏樣品的采集；

（2）通過高溫滅活樣品中除能形成芽孢的菌以外的其它微生物；

（3）收集滅活后樣品中的芽孢；

（4）將收集的芽孢接種于培養(yǎng)基、在油藏原位溫度條件下對芽孢菌進(jìn)行復(fù)活培養(yǎng)；

（5）通過分子生物學(xué)方法檢測復(fù)活的芽孢菌菌群。

2.如權(quán)利要求1所述的油藏中芽孢桿菌（Bacillus）的快速檢測方法，其特征在于，所述油藏為不同地質(zhì)條件、不同開采方法的各類油藏。

3.如權(quán)利要求2所述的油藏中芽孢桿菌（Bacillus）的快速檢測方法，其特征在于，油藏樣品包括：注水井井口樣品，油井井口樣品，地層水樣品，油井返排樣品以及巖芯樣品。

4.如權(quán)利要求3所述的油藏中芽孢桿菌（Bacillus）的快速檢測方法，其特征在于，油藏樣品的采集步驟為將采集的油藏樣品裝入已滅菌的樣品瓶中，裝滿樣品瓶，密封，記錄樣品采集的油藏原位溫度。

5.如權(quán)利要求4所述的油藏中芽孢桿菌（Bacillus）的快速檢測方法，其特征在于，通過高溫滅活樣品中除能形成芽孢的菌以外的其它微生物步驟為，在無菌條件下取500ml?的油藏樣品到無菌燒瓶中，燒瓶口覆蓋上有透氣孔的無菌微生物培養(yǎng)膜；將燒瓶加熱，保持沸騰10分鐘，室溫冷卻。

6.如權(quán)利要求5所述的油藏中芽孢桿菌（Bacillus）的快速檢測方法，其特征在于，收集滅活后樣品中的芽孢步驟具體操作為：待燒瓶中樣品冷卻后，在無菌條件下將燒瓶中的樣品轉(zhuǎn)移到多個50ml的無菌離心管中，10000g離心力離心15分鐘，在無菌條件下將上清液轉(zhuǎn)移到一個干凈的無菌容器中保存為待用上清液；

然后在每個離心管中加入1ml的無菌水、重懸浮離心管底部收集到的沉淀物，將所有離心管中的重懸浮液收集到一起成為10ml的混合液；混合液中包含有芽孢。

7.如權(quán)利要求6所述的油藏中芽孢桿菌（Bacillus）的快速檢測方法，其特征在于，將收集的芽孢接種于培養(yǎng)基、在油藏原位溫度條件下對芽孢菌進(jìn)行復(fù)活培養(yǎng)步驟具體為：將收集到的10ml的混合液作為種子，在無菌條件下接種到裝有30ml培養(yǎng)基的100ml培養(yǎng)瓶中，密封瓶口，在樣品采集的油藏原位溫度10℃-110℃條件下，搖菌（150rmp）對芽孢菌進(jìn)行復(fù)活培養(yǎng)7-15天，得復(fù)活培養(yǎng)液；

所述的培養(yǎng)基是指與微生物原來生長環(huán)境相匹配，并能為芽孢復(fù)活提供營養(yǎng)物的培養(yǎng)基，培養(yǎng)基成分為：糖蜜2g，（NH4）2HPO4?0.16g，KNO3?0.2g，用待用上清液配制并定容到100ml，加入原油?2g；121℃滅菌20分鐘高壓蒸汽滅菌，原油來自樣品采集油藏。

8.如權(quán)利要求7所述的油藏中芽孢桿菌（Bacillus）的快速檢測方法，其特征在于，通過分子生物學(xué)方法檢測復(fù)活的芽孢菌菌群步驟具體操作為：在無菌條件下吸取5ml復(fù)活培養(yǎng)液于離心管中，10000g離心力離心10分鐘，移除上清，在離心管中加入1ml無菌水，重懸浮離心管底沉淀；

通過DNA試劑盒FastDNA?Spin?Kit?for?Soil來抽提重懸浮液中的DNA，構(gòu)建16S?rDNA克隆文庫，基因測序以及微生物系統(tǒng)發(fā)育分析來完成對芽孢桿菌的檢測和分析。