[發(fā)明專利]用Morpholino對其互補DNA進(jìn)行保護的方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210497199.4
• 申請日: 2012-11-29
• 公開（公告）號: CN102943072A
• 公開（公告）日: 2013-02-27
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 王康;夏興華;曹雷;王鳳彬;吉麗娜
• 申請（專利權(quán)）人: 南京大學(xué)
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C07H1/00;C07H21/04
• 代理公司: 江蘇致邦律師事務(wù)所 32230
• 代理人: 徐蓓

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種DNA的保護方法，特別涉及一種利用DNA類似物Morpholino（MO）與DNA形成雙鏈，從而保護DNA不被核酸酶切的方法，屬于生物化學(xué)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

DNA是一種重要的生命物質(zhì)，是大多數(shù)生物的遺傳信息載體。基于DNA的雜交/去雜交、在特定環(huán)境下的結(jié)構(gòu)互變、酶切前后的構(gòu)型改變等原理的DNA傳感器或其他分子器件，已經(jīng)成為現(xiàn)代生命分析領(lǐng)域的研究熱點。

核酸酶是一類可以將核酸鏈水解成低聚核苷酸或者單核苷酸的酶，它通過水解核酸鏈中的磷酸二酯鍵來打斷長鏈，根據(jù)其作用機制，又可分為內(nèi)切酶與外切酶等類別。能夠?qū)Ｒ蛔R別特定序列并切斷核酸鏈的限制性內(nèi)切酶，已經(jīng)廣泛應(yīng)用用基因測序及分子克隆工作中。

核酸酶的存在導(dǎo)致DNA分子器件的使用壽命十分有限，使得其實際應(yīng)用受到了極大的制約。而且，在分子器件的實際檢測中，固定在表面的探針DNA分子由于荷負(fù)電而在固液界面間形成具有高電荷密度的界面電場。所以DNA的雜交需要克服極高的靜電排斥力，也需要較高鹽濃度的溶液體系。

綜上所述，如何提高DNA鏈在分子器件中的穩(wěn)定性，是一個具有實際意義的問題。

發(fā)明內(nèi)容

為了解決DNA分子器件中DNA?鏈的穩(wěn)定性問題，本發(fā)明考慮到了使用中性的DNA類似物，是一類與DNA具有相同堿基，但骨架結(jié)構(gòu)為中性的人工核酸分子。這些類似物在生物學(xué)中通常用于抗轉(zhuǎn)錄研究。DNA中性類似物的鏈狀分子結(jié)構(gòu)與目標(biāo)DNA間不存在靜電排斥力，在低鹽濃度下即可與DNA形成熱力學(xué)穩(wěn)定性的雙鏈復(fù)合結(jié)構(gòu)，并具有優(yōu)良的抵抗核酸酶降解作用的能力，因此適合應(yīng)用于DNA分子器件中。

本發(fā)明中使用的Morpholino（以下可簡稱MO）是一種不帶電荷的人造核酸，其分子結(jié)構(gòu)與DNA類似（DNA結(jié)構(gòu)式見圖1-1），只是糖環(huán)被嗎啉基取代，磷酸骨架上一個O原子被-N(CH₃)₂取代。（MO結(jié)構(gòu)式見圖1-2）。

與其他中性類似物諸如磷酸甲基化的核酸?(methylphosphonated?nucleotides,?MP)、肽核酸（Peptide?nucleic?acid,?PNA）相比，MO具有更加靈活的骨架結(jié)構(gòu)，分子內(nèi)堿基堆積作用的增強使其水溶性達(dá)到或超過相同序列的DNA分子，且MO形成的單層具有較高的分散性，有利于實現(xiàn)目標(biāo)DNA的快速充分雜交；同時，由于MO高的水溶性，合成難度，價格均低于PNA，因此?，MO在分子器件中具有極大的應(yīng)用前景。

研究已經(jīng)表明，Morpholino本身具有抗核酸酶切的性質(zhì)，可以考慮將它應(yīng)用到分子器件的構(gòu)建中。

本發(fā)明的目的則是在于提供一種用Morpholino對其互補DNA進(jìn)行保護的方法，為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

一種用Morpholino對其互補DNA進(jìn)行保護的方法，通過在金電極表面修飾Morpholino單鏈，再將該Morpholino單鏈同相應(yīng)序列的DNA單鏈進(jìn)行雜交，使其具有抗酶切保護作用。

具體地，上述方法包括如下步驟：

（1）將巰基修飾的Morpholino單鏈固定到金電極表面，然后用3-巰基丙醇封閉；

（2）將修飾好Morpholino單鏈的金電極放在含其互補DNA單鏈的雜交溶液中進(jìn)行雜交。

其中，所述的步驟1為：對金電極進(jìn)行預(yù)處理后放入以去離子水配制的0.5-1.5μM的MO-SH溶液中修飾25-35min，優(yōu)選放入以去離子水配制的1μM的MO-SH溶液中修飾30min。

上述步驟中，將金電極先后用0.3μm、0.05μm的氧化鋁粉打磨后，用去離子水超聲清洗；用電化學(xué)方式拋光后，再次用去離子水洗凈，完成預(yù)處理。

本發(fā)明所述的方法，所述步驟1中，3-巰基丙醇濃度為0.8-1.5mM，封閉時間為0.5-1.5h；優(yōu)選所述3-巰基丙醇濃度為1mM，封閉時間為1h。

本發(fā)明所述的方法，所述雜交溶液為DNA濃度為0.5-1.5μM的MgCl₂溶液，其中MgCl₂溶液的濃度為0.8-1.2M，雜交時間為3-5h；優(yōu)選DNA濃度為1μM的MgCl₂溶液，其中MgCl₂溶液的濃度為1M；雜交時間為4h。

本發(fā)明所述方法在25-35℃恒溫水浴中進(jìn)行。