[發(fā)明專利]一種高通量乙型腦炎病毒解旋酶抑制劑的藥物篩選模型的建立方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210497118.0
• 申請日: 2012-11-28
• 公開（公告）號: CN102994611A
• 公開（公告）日: 2013-03-27
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 宋云峰;方金娥;曹勝波;陳煥春
• 申請（專利權(quán)）人: 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12Q1/25
• 分類號: C12Q1/25;C12N15/52;C12N15/70;C12N9/00;G01N21/64
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務(wù)所 42001
• 代理人: 王敏鋒

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種高通量乙型腦炎病毒解旋酶抑制劑的藥物篩選模型的建立方法，可用于藥物的篩選。

背景技術(shù)

乙型腦炎病毒不僅引起人的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，還可引起豬的繁殖障礙性疾病，是一種重要的人畜共患傳染病病原。乙型腦炎病毒主要侵入神經(jīng)系統(tǒng)，包括丘腦，基底神經(jīng)節(jié)，腦干，小腦，大腦皮層和脊髓，導(dǎo)致嚴(yán)重的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，例如脊髓灰質(zhì)炎樣嚴(yán)重癱瘓，無菌性腦膜炎和腦炎，71%的患者都是基底神經(jīng)節(jié)和丘腦損傷，嚴(yán)重出現(xiàn)運(yùn)動障礙，43%患者腦干損傷，經(jīng)常出現(xiàn)急性呼吸衰竭癥狀，甚至死亡?；颊叩牟∷缆逝c臨床癥狀高達(dá)10%～50%，而且大約一半乙型腦炎病毒感染幸存者都有嚴(yán)重的神經(jīng)后遺癥。在亞洲每年大約50,000乙腦病例中就有15,000例死亡。2006年7月山西發(fā)生日本乙型腦炎流行，共60多人發(fā)病，其中19人死亡，造成了較大的社會影響。

目前已研制出乙型腦炎病毒的弱毒疫苗和滅活疫苗，具有較好的免疫效果，但仍有免疫失敗的報道。同時，日本乙型腦炎發(fā)病后在腦中復(fù)制，給病人造成不可逆的智力損傷，如果能使用藥物對該病起到一定的早期預(yù)防和治療效果，則對于該病的治療手段的研究具有重大意義。而目前仍未有關(guān)于乙型腦炎病毒藥物及其篩選方法的報道。

乙型腦炎病毒病毒NS3的C端440個氨基酸為解旋酶和NTP酶，它可以利用水解ATP釋放的能量，將病毒在復(fù)制過程中形成的RNA雙鏈解旋。解旋酶是乙型腦炎病毒的復(fù)制所必需，該酶失去活性后病毒增殖停止，因此成為良好的抗病毒靶標(biāo)。根據(jù)解旋酶的酶活性特征，具有多種靶向藥物篩選與設(shè)計的策略，如：a.阻止ATP的結(jié)合；b.阻止RNA底物的結(jié)合；c.阻止解旋酶的空間變構(gòu)。Borowski?P等（2002）合成了一種環(huán)擴(kuò)大核苷（ring-expanded?nucleoside），對于西尼羅病毒解旋酶具有一定的抑制活性（IC50=25-30uM）。Kaczor?A等（2010）根據(jù)日本乙型腦炎病毒的解旋酶結(jié)構(gòu)，建立了一個基于酶結(jié)構(gòu)的藥效團(tuán)模型，用該模型對116萬個化合物進(jìn)行了虛擬篩選，發(fā)現(xiàn)了15個化合物具有較好的結(jié)合活性，并且預(yù)測了其可以通過血腦屏障，但未進(jìn)行酶抑制活性的試驗研究。但是，到目前為止針對乙型腦炎病毒解旋酶的藥物設(shè)計模型仍然沒有建立，也未見針對乙型腦炎病毒解旋酶的藥物報道。本發(fā)明建立了一種針對乙型腦炎病毒解旋酶的藥物篩選模型，應(yīng)用該模型可在蛋白水平進(jìn)行高通量、低成本的進(jìn)行乙型腦炎抗病毒藥物篩選，為乙型腦炎病毒的藥物發(fā)現(xiàn)提供了一種手段。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供了一種高通量乙型腦炎病毒解旋酶抑制劑的藥物篩選模型的建立方法，方法簡單，易于操作。解旋酶是乙型腦炎病毒基因組編碼的一種功能蛋白，該蛋白負(fù)責(zé)將病毒復(fù)制過程中形成的基因組RNA雙鏈解旋，解旋后的正鏈RNA參與子代病毒的包裝過程，如果抑制解旋酶的活性，乙型腦炎病毒的增殖也將受到抑制。本發(fā)明是基于解旋酶活性的機(jī)制，采用熒光共振能量轉(zhuǎn)移的方法，在兩條底物DNA的兩端分別標(biāo)記熒光和淬滅基團(tuán)，當(dāng)兩條底物形成雙鏈后，熒光基團(tuán)的能量被淬滅基團(tuán)吸收，因此體系中不發(fā)出熒光。當(dāng)解旋酶將雙鏈解開后，兩個基團(tuán)在空間上距離變大，熒光基團(tuán)則發(fā)出熒光，熒光強(qiáng)度越高則說明酶活性越高?；谠撁富钚缘脑u價體系，進(jìn)一步建立了抑制劑篩選方法，并進(jìn)行了初步應(yīng)用。

為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采取如下技術(shù)措施：

一種高通量乙型腦炎病毒解旋酶抑制劑的藥物篩選模型的建立方法，其制備步驟如下：

（1）解旋酶蛋白的表達(dá)與純化：人工合成乙型腦炎病毒NS3基因（Genbank登錄號：U47032），用Nco?I和Xho?I分別酶切解旋酶片段與大腸桿菌原核表達(dá)載體pET30a，T4?DNALigase（TakaRa,大連寶生物工程有限公司）16℃過夜連接，得到重組質(zhì)粒pET30a-helicase，構(gòu)建好的重組質(zhì)粒pET30a-helicase轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21（DE3）plysS中進(jìn)行表達(dá)，得到一種解旋酶蛋白，其序列為SEQ?ID?NO.1所示。收集表達(dá)蛋白上清用Ni²⁺親和純化，純化的解旋酶蛋白經(jīng)SDS-PAGE及Western?blot鑒定后加甘油至終濃度20%（v/v），用BCA法測定濃度，-80℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

用大腸桿菌大量表達(dá)解旋酶蛋白，在表達(dá)蛋白上帶有6×His標(biāo)簽，收集表達(dá)蛋白的上清，用Ni²⁺親和層析法純化解旋酶蛋白，用BCA法測定蛋白濃度。

（2）解旋酶DNA底物的設(shè)計：人工合成3條DNA鏈，分別命名為F、Q、C，序列分別為：