[發(fā)明專利]一種高通量乙型腦炎病毒解旋酶抑制劑的藥物篩選模型的建立方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210497118.0
• 申請日: 2012-11-28
• 公開（公告）號: CN102994611A
• 公開（公告）日: 2013-03-27
• 發(fā)明（設計）人: 宋云峰;方金娥;曹勝波;陳煥春
• 申請（專利權）人: 華中農(nóng)業(yè)大學
• 主分類號: C12Q1/25
• 分類號: C12Q1/25;C12N15/52;C12N15/70;C12N9/00;G01N21/64
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務所 42001
• 代理人: 王敏鋒

1.一種高通量乙型腦炎病毒解旋酶抑制劑的藥物篩選模型的建立方法，其制備步驟如下：

（1）解旋酶蛋白的表達與純化：人工合成乙型腦炎病毒NS3基因，用Nco?I和Xho?I分別酶切解旋酶片段與大腸桿菌原核表達載體pET30a，T4?DNA?Ligase?16℃過夜連接，得到重組質(zhì)粒pET30a-helicase，構建好的重組質(zhì)粒pET30a-helicase轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21（DE3）plysS中進行表達，得到一種解旋酶蛋白，其序列為SEQ?ID?NO.1所示，收集表達蛋白上清用Ni²⁺親和純化，純化的解旋酶蛋白經(jīng)SDS-PAGE及Western?blot鑒定后加甘油至終濃度20%?v/v，用BCA法測定濃度，-80℃凍存?zhèn)溆茫挥么竽c桿菌大量表達解旋酶蛋白，在表達蛋白上帶有6×His標簽，收集表達蛋白的上清，用Ni²⁺親和層析法純化解旋酶蛋白，用BCA法測定蛋白濃度；

（2）解旋酶DNA底物的設計：人工合成3條DNA鏈，分別命名為F、Q、C，序列分別為：

F:?(Cy5-)TAGTACCGCCACCCTCAGAACCTTTTTTTTTTTTTT；

Q:GGTTCTGAGGGTGGCGGTACTA-(BHQ2)；

C:TAGTACCGCCACCCTCAGAACC；

（3）在黑色96孔或384孔板中加入解旋酶蛋白3uM、待篩化合物以及反應緩沖液，混合孵育5分鐘后，加入F鏈200nM與Q鏈240nM，再孵育5分鐘，加入C鏈2.4uM、15mM?Mg²⁺/10mM的Mn²⁺和ATP?2mM，置37℃反應90分鐘后，在熒光檢測儀中檢測體系中的熒光強度，同時設置不加入待篩化合物的對照組以及不加入底物的對照組；

（4）計算化合物抑制率：抑制率=1-（實驗組熒光平均值-C1組熒光平均值）÷（C組熒光平均值-C1組熒光平均值），選擇抑制率最高的化合物進行抗病毒的研究。