[發明專利]艱難梭菌腸毒素A、B雙重熒光定量PCR檢測方法及檢測用試劑盒無效
| 申請號： | 201210496620.X | 申請日： | 2012-11-28 |
| 公開（公告）號： | CN102952886A | 公開（公告）日： | 2013-03-06 |
| 發明（設計）人： | 邵景東;王毅謙;李輝;傅春玲;吳福平;郭旸 | 申請（專利權）人： | 中華人民共和國張家港出入境檢驗檢疫局 |
| 主分類號： | C12Q1/68 | 分類號： | C12Q1/68;C12N15/11;C12R1/145 |
| 代理公司： | 上海浦一知識產權代理有限公司 31211 | 代理人： | 劉昌榮 |
| 地址： | 215600 江蘇省*** | 國省代碼： | 江蘇;32 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 艱難 梭菌腸 毒素 雙重 熒光 定量 pcr 檢測 方法 試劑盒 | ||
1.艱難梭菌腸毒素A、B雙重熒光定量PCR檢測方法，其特征在于，包括以下步驟：
1）提取待測樣品DNA；
2）以待測樣品DNA為模板，進行熒光定量PCR反應；
3）對PCR反應中每個循環產物的熒光進行檢測，根據熒光檢測的最低Ct值和最高熒光強度，判斷待測樣品中是否含有艱難梭菌腸毒素A、B。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，PCR反應體系為：2×HR?qPCR?Master?Mix12.5μl，10μmol/L上、下游引物各1μl，10μmol/L熒光探針0.5μl，DNA模板2-3μl，DEPC水補足25μl。
3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，PCR反應條件為：95℃?5min；然后95℃?10s，55℃?40s，共40個循環。
4.用于特異擴增艱難梭菌腸毒素A基因的引物對，其特征在于，該引物對的上游引物具有如SEQ?ID?No:1所示的序列或其互補序列，該引物對的下游引物具有如SEQ?ID?No:2所示的序列或其互補序列。
5.用于特異擴增艱難梭菌腸毒素B基因的引物對，其特征在于，該引物對的上游引物具有如SEQ?ID?No:4所示的序列或其互補序列，該引物對的下游引物具有如SEQ?ID?No:5所示的序列或其互補序列。
6.用于特異檢測艱難梭菌腸毒素A基因的熒光探針，其特征在于，該探針具有如SEQ?IDNO:3所示的序列，序列的兩端分別帶熒光基團和淬滅基團。
7.用于特異檢測艱難梭菌腸毒素B基因的熒光探針，其特征在于，該探針具有如SEQ?IDNO:6所示的序列，序列的兩端分別帶熒光基團和淬滅基團。
8.用于權利要求1-3任何一項所述檢測方法的試劑盒，其特征在于，包括權利要求4和5的引物對，以及權利要求6和7的探針。
9.根據權利要求8所述的試劑盒，其特征在于，還包括用作陽性質控品的艱難梭菌腸毒素A、B基因標準品。
10.根據權利要求8所述的試劑盒，其特征在于，還包括脫氧三磷酸核苷混合物、氯化鎂、DNA聚合酶。
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