[發(fā)明專利]艱難梭菌腸毒素A、B雙重熒光定量PCR檢測方法及檢測用試劑盒

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210496620.X
• 申請日: 2012-11-28
• 公開（公告）號: CN102952886A
• 公開（公告）日: 2013-03-06
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 邵景東;王毅謙;李輝;傅春玲;吳福平;郭旸
• 申請（專利權(quán)）人: 中華人民共和國張家港出入境檢驗檢疫局
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11;C12R1/145
• 代理公司: 上海浦一知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 31211
• 代理人: 劉昌榮

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物醫(yī)學領(lǐng)域，特別是涉及艱難梭菌腸毒素A、B的檢測方法及檢測用試劑盒。

背景技術(shù)

艱難梭菌（Clostridium?difficile）是具有芽胞結(jié)構(gòu)的革蘭氏陽性厭氧桿菌，是公認的院內(nèi)感染和抗生素相關(guān)性腹瀉最重要的病原體，通過釋放細胞毒素可引起偽膜性腸炎，甚至可致死。艱難梭菌可釋放多種毒素，其中以A、B兩種毒素為主，這兩種毒素是導致腹瀉與腸炎癥的主要原因。

艱難梭菌實驗診斷方法主要依靠傳統(tǒng)的厭氧培養(yǎng)、細胞毒性試驗、菌體及毒素抗原檢測。其中，細菌厭氧培養(yǎng)和細胞毒素中和實驗是目前實驗室檢測艱難梭菌的“金標準”。細菌培養(yǎng)是傳統(tǒng)檢測方法中最靈敏的方法，但是必須進行二次檢測以判斷產(chǎn)物毒素是否存在，并且需要進行細胞毒素試驗以驗證是否為產(chǎn)毒艱難梭菌。該試驗的特異性和靈敏性較好，但是條件設(shè)備要求高，還需要專業(yè)的細胞培養(yǎng)技術(shù)和連續(xù)的組織培養(yǎng)，僅培養(yǎng)時間至少需要24h以上，影響臨床做出及時診斷和治療。因此傳統(tǒng)方法在日常監(jiān)控、暴發(fā)事件病原體確定和溯源追蹤等方面存在著瓶頸。

隨著免疫學和分子生物學的發(fā)展，近二十年來一系列的快速檢測方法被應(yīng)用到微生物的檢測和鑒定中。這些快速檢測方法能夠在48小時內(nèi)得到結(jié)果。現(xiàn)階段研究較為深入的快速檢測方法包括酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）。谷氨酸脫氫酶（GDH）為艱難梭菌表面大量表達的抗原性酶蛋白，但免疫酶學試驗無法區(qū)分艱難梭菌產(chǎn)毒株與非產(chǎn)毒菌株。另外，目前商品化免疫學的艱難梭菌毒素診斷產(chǎn)品只能檢測A毒素，這導致臨床A-B+艱難梭菌引發(fā)的許多患者漏診，使A-B+型艱難梭菌引起的嚴重感染和爆發(fā)報道增多。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題之一是提供一種艱難梭菌腸毒素A、B雙重熒光定量PCR檢測方法，它可以快速、簡便地檢測艱難梭菌，且檢測的靈敏性和特異性高。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的艱難梭菌腸毒素A、B雙重熒光定量PCR檢測方法，步驟包括：

1）提取待測樣品DNA；

2）以待測樣品DNA為模板，進行熒光定量PCR反應(yīng)；

3）對PCR反應(yīng)中每個循環(huán)產(chǎn)物的熒光進行檢測，根據(jù)熒光檢測的最低Ct值和最高熒光強度，判斷待測樣品中是否含有艱難梭菌腸毒素A、B。

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題之二是提供用于上述方法的特異性擴增艱難梭菌腸毒素A基因的引物對。該引物對的上游引物具有如SEQ?ID?No:1所示的序列或其互補序列，下游引物具有如SEQ?ID?No:2所示的序列或其互補序列。

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題之三是提供用于上述方法的特異性擴增艱難梭菌腸毒素B基因的引物對。該引物對的上游引物具有如SEQ?ID?No:4所示的序列或其互補序列，下游引物具有如SEQ?ID?No:5所示的序列或其互補序列。

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題之四是提供用于上述方法的特異性檢測艱難梭菌腸毒素A的熒光探針。該探針具有如SEQ?ID?NO:3所示的序列，序列的兩端分別帶熒光基團和淬滅基團。

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題之五是提供用于上述方法的特異性檢測艱難梭菌腸毒素B的熒光探針。該探針具有如SEQ?ID?NO:6所示的序列，序列的兩端分別帶熒光基團和淬滅基團。

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題之六是提供用于上述檢測方法的試劑盒。該試劑盒包括有上述特異擴增艱難梭菌腸毒素A、B基因的引物對和特異檢測艱難梭菌腸毒素A、B的熒光探針。

與現(xiàn)有檢測方法相比，本發(fā)明的雙重熒光定量PCR檢測方法，不僅能檢測艱難梭菌腸毒素A，而且能同時檢測艱難梭菌腸毒素B，從而有助于臨床對由A-B+艱難梭菌引發(fā)的患者的及時診斷，減少A-B+型艱難梭菌引起的嚴重感染。另外，本發(fā)明的檢測方法不僅操作簡便、快速，而且檢測的靈敏性和特異性高，可應(yīng)用于艱難梭菌引起突發(fā)疫情的實驗室應(yīng)急檢測。

附圖說明

圖1是艱難梭菌腸毒素A的熒光qPCR擴增曲線圖。曲線1至5依次為100000、10000、1000、100、10拷貝數(shù)。

圖2是艱難梭菌腸毒素A的熒光qPCR定量標準曲線。

圖3是艱難梭菌腸毒素B的熒光qPCR擴增曲線圖。曲線1至5依次為100000、10000、1000、100、10拷貝數(shù)。

圖4是艱難梭菌腸毒素B的熒光qPCR定量標準曲線。

具體實施方式

為對本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容、特點與功效有更具體的了解，現(xiàn)結(jié)合附圖，詳述如下：

實施例1

1．實驗材料

1.1細菌株與待測樣品