[發(fā)明專利]一種提高水曲柳體細(xì)胞胚誘導(dǎo)率的方法

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210493495.7
• 申請(qǐng)日: 2012-11-28
• 公開（公告）號(hào): CN102948369A
• 公開（公告）日: 2013-03-06
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 楊玲
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 東北林業(yè)大學(xué);楊玲
• 主分類號(hào): A01H4/00
• 分類號(hào): A01H4/00
• 代理公司: 哈爾濱市松花江專利商標(biāo)事務(wù)所 23109
• 代理人: 王艷萍

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種提高體細(xì)胞胚誘導(dǎo)率的方法。

背景技術(shù)

水曲柳(Fraxinus?mandshurica?Rupr.)屬木犀科白蠟樹屬，是我國(guó)東北重要的經(jīng)濟(jì)和生態(tài)用樹種之一。水曲柳材質(zhì)優(yōu)良，強(qiáng)度適中，紋理美觀，木材利用價(jià)值極高，是著名的軍事用材和高級(jí)家具用材，與胡桃楸、黃菠蘿同稱為“東北三大硬闊”。同時(shí)，水曲柳是東北林區(qū)頂級(jí)群落紅松針闊混交林的重要伴生樹種之一。然而，水曲柳的資源歷來非常缺乏，加之長(zhǎng)期的過渡采伐和不合理利用，其資源已將近枯竭，生態(tài)環(huán)境問題日益嚴(yán)重。另外水曲柳母樹結(jié)實(shí)情況受環(huán)境條件影響很大，種子的供應(yīng)常有不足。

水曲柳體細(xì)胞胚胎發(fā)生技術(shù)為解決水曲柳種子匱乏和水曲柳優(yōu)良品系種質(zhì)保存的問題提供了一個(gè)重要的方法和手段。然而水曲柳體細(xì)胞胚胎發(fā)生還存在很多困難，比如體細(xì)胞胚的誘導(dǎo)率和轉(zhuǎn)換率低等問題。目前，水曲柳胚性組織的誘導(dǎo)主要是利用未成熟合子胚(以授粉后9周左右采集的未成熟合子胚為最佳外植體)，體細(xì)胞胚誘導(dǎo)率平均在30～35％。并且存在外植體取材時(shí)期受季節(jié)(每年7月中旬左右，即授粉后9周)和地點(diǎn)(水曲柳母樹林或種子園)限制、外植體來源不足(水曲柳母樹結(jié)實(shí)具有大小年和結(jié)實(shí)間隔期)等問題。若采用成熟合子胚為外植體，則具有易于取材、不受時(shí)間地點(diǎn)限制等優(yōu)點(diǎn)，易于大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化繁殖。但在現(xiàn)有的技術(shù)中，以水曲柳成熟合子胚為外植體的體細(xì)胞胚誘導(dǎo)率最高才15％，不能滿足水曲柳體細(xì)胞胚大規(guī)模誘導(dǎo)和培養(yǎng)的需求，無法實(shí)現(xiàn)水曲柳體細(xì)胞胚的工廠化和自動(dòng)化生產(chǎn)。因此，迫切需要改進(jìn)現(xiàn)有的水曲柳體細(xì)胞胚誘導(dǎo)技術(shù)，以提高水曲柳體細(xì)胞胚的誘導(dǎo)率，實(shí)現(xiàn)水曲柳優(yōu)良品系的大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化繁殖。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明目的是為了解決現(xiàn)有水曲柳體細(xì)胞胚胎發(fā)生技術(shù)中存在體細(xì)胞胚誘導(dǎo)率低、外植體取材受季節(jié)和地點(diǎn)限制、外植體來源不足的問題，而提供一種提高水曲柳體細(xì)胞胚誘導(dǎo)率的方法。

提高水曲柳體細(xì)胞胚誘導(dǎo)率的方法按以下步驟實(shí)現(xiàn)：

一、取水曲柳成熟種子進(jìn)行消毒處理，然后剝離出合子胚，切取合子胚的單片子葉接種到含1.0～2.0mg/L芐基腺嘌呤(BA)、2.5～5.0mg/L生長(zhǎng)素、200～700mg/L酸性水解酪蛋白、75～125g/L蔗糖和6～7g/L瓊脂的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，在溫度為20～30℃、濕度為40％～70％、無光照的條件下培養(yǎng)2～4周，得胚性組織；

二、將胚性組織接種到含0～2.0mg/L芐基腺嘌呤、0～5.0mg/L生長(zhǎng)素、200～700mg/L酸性水解酪蛋白、20～30g/L蔗糖和6～7g/L瓊脂的繼代培養(yǎng)基中，在溫度為20～30℃、濕度為40％～70％、無光照的條件下繼續(xù)培養(yǎng)2～4周，得各種不同發(fā)育時(shí)期的體細(xì)胞胚，即完成提高水曲柳體細(xì)胞胚誘導(dǎo)率的方法；

其中步驟一中誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS1/2培養(yǎng)基或WPM培養(yǎng)基，pH值均為5～6；

步驟一中生長(zhǎng)素為2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)或萘乙酸(NAA)；

步驟二中繼代培養(yǎng)基為MS1/2培養(yǎng)基或MS培養(yǎng)基，pH值均為5～6；

步驟二中生長(zhǎng)素為2，4-二氯苯氧乙酸或萘乙酸。

本發(fā)明中提高水曲柳體細(xì)胞胚誘導(dǎo)率的方法成本低、操作簡(jiǎn)單，通過調(diào)節(jié)體細(xì)胞胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的蔗糖濃度或甘露醇濃度，可調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的滲透壓，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)水曲柳體細(xì)胞胚誘導(dǎo)率提高的物理調(diào)控，使體細(xì)胞胚誘導(dǎo)率提高到70％以上(現(xiàn)有的技術(shù)中以水曲柳成熟合子胚為外植體的體細(xì)胞胚誘導(dǎo)率最高才15％)，單個(gè)外植體上的體細(xì)胞胚數(shù)量達(dá)70個(gè)以上。本發(fā)明可以實(shí)現(xiàn)提高水曲柳體細(xì)胞胚誘導(dǎo)率、增加體細(xì)胞胚數(shù)量、提高繁殖效率的目標(biāo)，而且本發(fā)明具有外植體來源廣泛，包括新采集的成熟種子、經(jīng)過各種方法貯藏不同時(shí)間的成熟種子均可作為外植體、外植體取材不受季節(jié)和地點(diǎn)限制的特點(diǎn)。

具體實(shí)施方式

具體實(shí)施方式一：本實(shí)施方式提高水曲柳體細(xì)胞胚誘導(dǎo)率的方法按以下步驟實(shí)現(xiàn)：

一、取水曲柳成熟種子進(jìn)行消毒處理，然后剝離出合子胚，切取合子胚的單片子葉接種到含1.0～2.0mg/L芐基腺嘌呤、2.5～5.0mg/L生長(zhǎng)素、200～700mg/L酸性水解酪蛋白、75～125g/L蔗糖和6～7g/L瓊脂的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，在溫度為20～30℃、濕度為40％～70％、無光照的條件下培養(yǎng)2～4周，得胚性組織；