[發(fā)明專(zhuān)利]miRNA檢測(cè)探針及miRNA的擴(kuò)增檢測(cè)方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210492810.4
• 申請(qǐng)日: 2012-11-28
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103834719A
• 公開(kāi)（公告）日: 2014-06-04
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張春陽(yáng);王國(guó)磊
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 深圳先進(jìn)技術(shù)研究院
• 主分類(lèi)號(hào): C12Q1/68
• 分類(lèi)號(hào): C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 深圳市科進(jìn)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 44316
• 代理人: 宋鷹武

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及分子生物學(xué)和核酸化學(xué)領(lǐng)域具體涉及一種miRNA檢測(cè)發(fā)夾探針及miRNA的擴(kuò)增檢測(cè)方法。

背景技術(shù)

MicroRNAs(miRNA)是真核細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的一類(lèi)有調(diào)控功能的非編碼RNA，通常大約有20-25個(gè)核苷酸。miRNA是由較長(zhǎng)的含有hairpin結(jié)構(gòu)的前體經(jīng)過(guò)Dicer酶的剪切加工成形的，隨后與RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體(miRISCs)結(jié)合，并通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)識(shí)別相應(yīng)的信使RNA(mRNA)。由于互補(bǔ)程度的不同，miRNA可以降解或阻遏靶mRNA的翻譯。研究表明miRNA在動(dòng)植物中有廣泛的表達(dá)，參與各種各樣的調(diào)節(jié)途徑，包括發(fā)育、病毒防御、造血過(guò)程、器官形成、細(xì)胞增殖和凋亡、脂肪代謝等。miRNA具有保守性，特異性和時(shí)序性，只在特定的細(xì)胞和組織中表達(dá)，因此決定了細(xì)胞和組織功能的特異性。區(qū)別于寡核苷酸和RNA的降解片段，miRNA?3’端為羥基，5’端有一個(gè)磷酸基。miRNA與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展進(jìn)程密切相關(guān)，miRNA的異常表達(dá)與腫瘤的分期、進(jìn)展及代謝有關(guān)，一些miRNA在正常細(xì)胞中表達(dá)量高，在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)降低，提示他們可能作為抑癌基因，作為抑癌基因的miRNA的缺失將導(dǎo)致或突變將導(dǎo)致細(xì)胞的轉(zhuǎn)化和癌基因的激活；一些miRNA會(huì)協(xié)同行使癌基因的功能，抑制凋亡蛋白的合成。miRNA可作為腫瘤監(jiān)測(cè)和腫瘤愈后的生物學(xué)標(biāo)志物，miRNA的檢測(cè)對(duì)于腫瘤的早期診斷和愈后診斷具有重要的意義。

miRNA分子的序列短小，在基因組中存在較多的互補(bǔ)序列，在不同生物體內(nèi)與靶標(biāo)結(jié)合的方式也不盡相同，而且通常還與多種蛋白相互作用，因此miRNA的高靈敏分析成為亟待解決的問(wèn)題?，F(xiàn)有的miRNA檢測(cè)技術(shù)主要包括Northern?blot(一種檢測(cè)RNA的雜交印跡技術(shù))，微陣列，RT-PCR(逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))，恒溫?cái)U(kuò)增等。其中，Northern?blot是在變性條件下將待檢的RNA樣品進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，繼而進(jìn)行轉(zhuǎn)膜和探針雜交檢測(cè)，這種方法的特異性非常高，但是工序復(fù)雜，需要的樣本量大，靈敏度低；微陣列法是采用特殊的玻片或硅芯片，在數(shù)平方厘米之面積上布放數(shù)千或數(shù)萬(wàn)個(gè)核酸探針，待檢樣品中的核酸與探針雜交結(jié)合后，借由熒光或電流等方式檢測(cè)，這種方法可以同時(shí)實(shí)現(xiàn)多重miRNA分析，但是檢測(cè)成本較高；RT-PCR技術(shù)是將RNA的逆轉(zhuǎn)錄和cDNA的聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增反應(yīng)相結(jié)合的技術(shù)，它能夠?qū)怂徇M(jìn)行高效率的擴(kuò)增；恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)能在恒溫條件下實(shí)現(xiàn)核酸的高效擴(kuò)增，其中鏈置換擴(kuò)增采用聚合酶和切刻酶對(duì)特定模板進(jìn)行循環(huán)地延伸、切刻，因而可擴(kuò)增產(chǎn)生大量的目的片段，但是對(duì)設(shè)備的要求很高。而近年來(lái)發(fā)展的采用發(fā)夾探針作為模板的鏈置換擴(kuò)增方法可實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增信號(hào)的實(shí)時(shí)采集，具有廣闊的應(yīng)用前景。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明旨在解決上述現(xiàn)有技術(shù)中存在的問(wèn)題提出一種miRNA的擴(kuò)增方法，實(shí)現(xiàn)miRNA的高靈敏度檢測(cè)。

為此，本發(fā)明提供了一種線(xiàn)性模版，用于miRNA檢測(cè)，包括三個(gè)部分，從3’端到5’端依次為：靠近3’端的第一結(jié)合位點(diǎn)，位于中間的是切刻內(nèi)切酶識(shí)別序列的互補(bǔ)序列，靠近5’端的第一擴(kuò)增區(qū)域；

所述的第一結(jié)合位點(diǎn)與待測(cè)miRNA具有互補(bǔ)配對(duì)序列；

所述的第一擴(kuò)增區(qū)域含有15-25個(gè)核苷酸，所述第一擴(kuò)增區(qū)域的互補(bǔ)序列可以作為引物引發(fā)延伸反應(yīng)。

優(yōu)選地，所述的線(xiàn)性模版具有序列表中SEQ?ID?No.1所示的核苷酸序列。

本發(fā)明另外提供了一種發(fā)夾探針，用于miRNA檢測(cè)，包括四個(gè)部分，從3’端到5’端依次為：靠近3’端的第二結(jié)合位點(diǎn)，第一莖區(qū)域，切刻內(nèi)切酶識(shí)別序列的互補(bǔ)序列，第二擴(kuò)增區(qū)域；

所述的第二結(jié)合位點(diǎn)與線(xiàn)性模版的第一擴(kuò)增區(qū)域有部分重復(fù)序列，能夠與所述的第一擴(kuò)增區(qū)域的互補(bǔ)序列進(jìn)行互補(bǔ)配對(duì)；

所述的第二擴(kuò)增區(qū)域與待測(cè)miRNA具有互補(bǔ)配對(duì)序列；

所述的第一莖區(qū)域與所述第二擴(kuò)增區(qū)域的反向序列有互補(bǔ)配對(duì)序列；

所述的第一莖區(qū)域與所述的第二擴(kuò)增區(qū)域通過(guò)發(fā)夾探針序列的自身回折進(jìn)行序列互補(bǔ)配對(duì)形成雙螺旋結(jié)構(gòu)，形成發(fā)夾探針的莖結(jié)構(gòu)；所述的切刻內(nèi)切酶識(shí)別序列的互補(bǔ)序列形成發(fā)夾探針的環(huán)結(jié)構(gòu)；所述的第二結(jié)合位點(diǎn)形成發(fā)夾探針的3’突出末端。

優(yōu)選地，所述的發(fā)夾探針具有序列表中SEQ?ID?No.2所示的核苷酸序列。

優(yōu)選地，所述的第二結(jié)合位點(diǎn)5’末端堿基上標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)；所述的第二擴(kuò)增區(qū)域5’末端堿基上標(biāo)記有熒光基團(tuán)。