[發(fā)明專利]miRNA檢測探針及miRNA的擴(kuò)增檢測方法

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210492810.4
• 申請(qǐng)日: 2012-11-28
• 公開（公告）號(hào): CN103834719A
• 公開（公告）日: 2014-06-04
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張春陽;王國磊
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 深圳先進(jìn)技術(shù)研究院
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 深圳市科進(jìn)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 44316
• 代理人: 宋鷹武

1.一種線性模版，用于miRNA檢測，包括三個(gè)部分，從3’端到5’端依次為：第一結(jié)合位點(diǎn)，切刻內(nèi)切酶識(shí)別序列的互補(bǔ)序列，第一擴(kuò)增區(qū)域；

所述的第一結(jié)合位點(diǎn)與待測miRNA具有互補(bǔ)配對(duì)序列；

所述的第一擴(kuò)增區(qū)域含有15-25個(gè)核苷酸，所述第一擴(kuò)增區(qū)域的互補(bǔ)序列作為引物引發(fā)延伸反應(yīng)。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的線性模版，其特征在于，具有序列表中SEQ?IDNo.1所示的核苷酸序列。

3.一種發(fā)夾探針，用于miRNA檢測，包括四個(gè)部分，從3’端到5’端依次為：第二結(jié)合位點(diǎn)，第一莖區(qū)域，切刻內(nèi)切酶識(shí)別序列的互補(bǔ)序列，第二擴(kuò)增區(qū)域；

所述的第二結(jié)合位點(diǎn)與權(quán)利要求1的線性模版的第一擴(kuò)增區(qū)域有部分重復(fù)序列，與所述的第一擴(kuò)增區(qū)域的互補(bǔ)序列進(jìn)行互補(bǔ)配對(duì)；

所述的第二擴(kuò)增區(qū)域與待測miRNA具有互補(bǔ)配對(duì)序列；

所述的第一莖區(qū)域與所述第二擴(kuò)增區(qū)域的反向序列有互補(bǔ)配對(duì)序列；

所述的第一莖區(qū)域與所述的第二擴(kuò)增區(qū)域通過發(fā)夾探針序列的自身回折進(jìn)行序列互補(bǔ)配對(duì)形成雙螺旋結(jié)構(gòu)，形成發(fā)夾探針的莖結(jié)構(gòu)；所述的切刻內(nèi)切酶識(shí)別序列的互補(bǔ)序列形成發(fā)夾探針的環(huán)結(jié)構(gòu)；所述的第二結(jié)合位點(diǎn)形成發(fā)夾探針的3’突出末端。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的發(fā)夾探針，其特征在于，所述的第二結(jié)合位點(diǎn)5’末端堿基上標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)；所述的第二擴(kuò)增區(qū)域5’末端堿基上標(biāo)記有熒光基團(tuán)。

5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的發(fā)夾探針，其特征在于，具有序列表中SEQ?IDNo.2所示的核苷酸序列。

6.一種利用權(quán)利要求1所述的線性模版和權(quán)利要求3所述的發(fā)夾探針進(jìn)行miRNA擴(kuò)增檢測的方法，包括以下步驟：

a、檢測探針的設(shè)計(jì)

根據(jù)待測miRNA序列設(shè)計(jì)權(quán)利要求1所述的線性模版，以及權(quán)利要求3所述的發(fā)夾探針，在第二結(jié)合位點(diǎn)5’末端堿基上標(biāo)記熒光淬滅基團(tuán)，在第二擴(kuò)增區(qū)域5’末端堿基上標(biāo)記熒光基團(tuán)；

b、線性模版的擴(kuò)增

將線性模版、dNTPs、待測miRNA樣品進(jìn)行混合，預(yù)熱后冷卻，得到第一混合溶液；

將切刻內(nèi)切酶、DNA聚合酶加入到第一混合溶液中，進(jìn)行延伸反應(yīng)，得到第二混合溶液；

c、發(fā)夾探針的擴(kuò)增

將發(fā)夾探針加入到步驟b中得到的第二混合溶液中，進(jìn)行熒光定量PCR，并對(duì)熒光信號(hào)的實(shí)時(shí)變化進(jìn)行監(jiān)測。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的miRNA擴(kuò)增檢測方法，其特征在于，所述????·的DNA聚合酶為高保真的耐熱DNA聚合酶。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的miRNA擴(kuò)增檢測方法，其特征在于，所述的DNA聚合酶具有3’到5’方向核酸外切酶校讀活性。

9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的miRNA擴(kuò)增檢測方法，其特征在于，所述的切刻內(nèi)切酶選自Nt．BstNBI、Nt．BbvCI或Nt．AlwI。

10.根據(jù)權(quán)利要求6所述的miRNA擴(kuò)增檢測方法，其特征在于，所述的線性模版的擴(kuò)增中預(yù)熱溫度為95℃。

11.根據(jù)權(quán)利要求6所述的miRNA擴(kuò)增檢測方法，其特征在于，所述的線性模版的擴(kuò)增中冷卻溫度為55℃。

12.根據(jù)權(quán)利要求6所述的miRNA擴(kuò)增檢測方法，其特征在于，所述的發(fā)夾探針的擴(kuò)增的溫度為52℃。