[發明專利]一種肺炎鏈球菌莢膜多糖蛋白結合疫苗的制備方法

在審

• 申請號: 201210491658.8
• 申請日: 2012-11-26
• 公開（公告）號: CN103830723A
• 公開（公告）日: 2014-06-04
• 發明（設計）人: 趙秋敏;孫倩;李軍強;金永杰;李亞冰;劉賀軍;曹小丹;李靜;李劍
• 申請（專利權）人: 天士力制藥集團股份有限公司
• 主分類號: A61K39/09
• 分類號: A61K39/09;A61P31/04
• 代理公司: 北京華科聯合專利事務所(普通合伙) 11130
• 代理人: 王為

技術領域：

本發明涉及一種疫苗的制備，特別涉及一種肺炎多糖蛋白結合疫苗及其制備方法。

背景技術：

肺炎鏈球菌（Streptococcus?pneumoniae）可引起鼻竇炎、中耳炎、氣管炎和肺炎等非侵襲性感染以及膿毒癥和腦膜炎等侵襲性感染，是一種引起所有年齡組高發病率和病死率的主要致病菌。在兒童呼吸系統中，肺炎發病率居第二位。世界衛生組織（WHO）調查數據顯示，每年死于肺炎鏈球菌感染的160萬人中，約有60%人群為5歲以下兒童。可見，肺炎鏈球菌堪稱威脅兒童健康的“頭號殺手”。目前，中國是全世界發病率高的五個亞洲國家之一。

在中國的調查數據顯示，由于抗生素的過度使用，目前肺炎球菌對于紅霉素和青霉素等常見抗菌素的耐藥性正在升高，《應高度重視兒童肺炎的預防措施）一文中提到例如血清6型對紅霉素的耐藥性已經達到百分之百。因此，接種肺炎球菌結合疫苗，是預防兒童患上肺炎球菌疾病的最佳方式。

目前，國內上市的肺炎球菌結合疫苗產品主要有輝瑞的7價肺炎球菌結合疫苗（PCV7），商品名為Prevenar，包含7種血清型的肺炎鏈球菌，分別為4,6B，9V，14,18C，19F和23F。PCV7的使用，降低了兒童侵襲性肺炎鏈球菌疾?。↖PD）的整體發病率。但是由于該疫苗價格昂貴，接種四針需要花費3000多人民幣，這或許會使許多家長望而卻步，放棄對孩子的接種。另一方面流行病學調查顯示，PCV7在美國和歐洲的覆蓋率為86%和74%，而在亞洲的覆蓋率僅為43%?，參見World?Health?Orgnization.?Pneumococcal?conjugated?vaccine?for?childhood?immunization-WHO?position?paper.?WklyEpidemiol?Rec,?2007,?82(12):?93-104?。而且廣泛使用PCV7后的檢測研究發現，非疫苗覆蓋血清型引起的IPD發病率持續升高，例如19A，在美國，2000-2005年由19A引起的侵襲性肺炎鏈球菌疾病的增長超過330%。這種血清型替代可能消弱PCV7帶來的益處。因此，開發價格適中并且適用中國國情的肺炎球菌結合疫苗迫在眉睫。?

由于肺炎鏈球菌莢膜多糖分子量大多大于1000KDa，且粘度較大，在與蛋白結合過程中容易交聯形成分子量更大的結合物凝膠，不利于分離純化，亦不利于控制多糖蛋白結合物中的蛋白與多糖的質量比。因此，需要將純化的莢膜多糖進行水解處理。世界專利WO?2008/079732?A2，提到可以用醋酸對18C型和3型莢膜多糖進行降解，其他專利如WO?2007/071707?A2提到可以用微流體化法對多糖進行降解。但上述方法對于某些特殊的肺炎鏈球菌莢膜多糖的分離效果不佳，如在用醋酸對9V型和4型多糖進行酸水解過程中，導致9V型和4型多糖的抗原性丟失，表現為免疫雙擴結果為陰性。

莢膜多糖的理化性質和生物活性與分子量及分子量分布有很大的關系。因此，在質量控制中，分子量是一個重要的指標。對于多糖類化合物，其分子量的描述和測定都較小分子困難得多。目前，傳統的測定多糖分子量的方法是通過分子量標準品校正曲線來確定分子量大小以及分子量的分布。這些方法存在的問題在于，當所測樣品的結構和性質與分子量標準品不同時，會給測定結果帶來明顯的誤差。參見Wang?W,?Bo?S,?Li?S,et?al?.Determination?of?the?Mark-Houwink?equation?for?chitosan?with?different?degrees?of?deacctylation.?Int?J?Biol?Macromol,1991,13:281。本發明采用高效凝膠體積排阻色譜（SEC）與多角度激光散射（MALLS）檢測器、示差折光（RI）檢測器聯用增加了測定結果的準確性。該方法可以直接反應各型多糖的絕對分子量大小，不會受到實驗條件的影響。操作更加簡捷，提高了工作效率。

本發明的目的之一在于提供一種多價或者13價肺炎多糖結合疫苗。其中13價疫苗含有13種血清型，分別為1,3,4,5,6A，6B，7F，9V，14,18C，19A，19F，23F。較目前上市的7價肺炎結合疫苗提供更廣泛的保護，而且成本經濟。本發明的目的之二在于公開一種莢膜多糖的水解方法——超聲降解，這種方法簡便易操作，且容易線性放大，多糖回收率達到90%以上。本發明的目的之三在于應用一種莢膜多糖分子量的測定方法—多角度激光散射法，該方法簡便快速，可以準確獲得分子量大小以及多糖的分散度等信息；本發明的目的之四在于提供一種多糖蛋白結合物的制備方法，CDAP活化多糖，該方法簡便，結合效率高。