[發明專利]一種肺炎鏈球菌莢膜多糖蛋白結合疫苗的制備方法

在審

• 申請號: 201210491658.8
• 申請日: 2012-11-26
• 公開（公告）號: CN103830723A
• 公開（公告）日: 2014-06-04
• 發明（設計）人: 趙秋敏;孫倩;李軍強;金永杰;李亞冰;劉賀軍;曹小丹;李靜;李劍
• 申請（專利權）人: 天士力制藥集團股份有限公司
• 主分類號: A61K39/09
• 分類號: A61K39/09;A61P31/04
• 代理公司: 北京華科聯合專利事務所(普通合伙) 11130
• 代理人: 王為

1.一種肺炎鏈球菌莢膜多糖蛋白結合疫苗的制備方法，包括將提取得到的肺炎鏈球菌莢膜多糖進行降解；降解后的肺炎鏈球菌莢膜多糖和載體蛋白結合，隨后制成疫苗制劑的步驟，其特征在于，其中降解后的肺炎鏈球菌莢膜多糖和載體蛋白結合，隨后制成疫苗制劑，包括以下步驟：

1）取降解后的肺炎鏈球菌莢膜多糖，溶解于溶液中，形成濃度為2-10mg/ml的多糖溶液；

2）向多糖溶液中緩慢加入濃度為100mg/ml的CDAP乙腈溶液，使得溶液中CDAP與莢膜多糖的質量比為0.5-1.5：1，維持1min-3min；

3）加入0.3M?NaOH調節pH至9-10，維持1-5min，加入濃度為2-10mg/ml的CRM197溶液，使得溶液中CRM197與多糖的質量比為1-1.5：1，維持pH9.5，室溫反應1-2h，加入2M甘氨酸終止反應，2-8℃緩慢攪拌6-18h；

4）利用Sepharose??4FF層析介質對結合物分別進行純化：用0.2M氯化鈉溶液洗脫，收集外水附近同時具有206nm和280nm吸收的洗脫液，即為單價結合物原液；0.22um無菌過濾后，2-8℃存放；

5）將肺炎鏈球菌莢膜多糖蛋白結合物和藥物可接受的輔料混合，按照常規技術制備成疫苗制劑。

2.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于，其中降解后的肺炎鏈球菌莢膜多糖和載體蛋白結合，隨后制成疫苗制劑包括以下步驟：

1）取降解后的肺炎鏈球菌莢膜多糖，分別溶解于二純水、2M?NaCl或者0.2M?NaCl溶液中，形成濃度為2-10mg/ml的多糖溶液；

2）向多糖溶液中緩慢加入濃度為100mg/ml的CDAP乙腈溶液，使得溶液中CDAP與莢膜多糖的質量比為1：1，維持1.5min-2min；

3）加入0.3M?NaOH調節pH至9.5，維持1-5min，加入溶度為5mg/ml的CRM197溶液，使得溶液中CRM197與多糖的質量比為1.2：1，維持pH9.5，室溫反應1-2h，加入2M甘氨酸終止反應,2-8℃緩慢攪拌6-18h;

4）利用Sepharose??4FF層析介質對結合物分別進行純化：用0.2M氯化鈉溶液洗脫，收集外水附近同時具有206nm和280nm吸收的洗脫液，即為單價結合物原液；0.22um無菌過濾后，4℃放置；

5）將肺炎鏈球菌莢膜多糖蛋白結合物和藥物可接受的輔料混合，按照常規技術制備成疫苗制劑。

3.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述CRM197蛋白可用TT蛋白代替。

4.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述將提取得到的肺炎鏈球菌莢膜多糖進行降解，方法如下：

1）將不同的血清型莢膜多糖分別溶于二純水中，制備成濃度為1-4mg/ml的溶液，低溫充分溶解；

2）冰水浴中，用功率為80-100W，頻率為20-40kHz的超聲波處理溶液；處理時間為10-30min，冷凍干燥；

3）利用MALLS分析降解后多糖的分子量大小，待分子量降解至目標大小為50KDa-500KDa時得降解多糖。

5.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述將提取得到的肺炎鏈球菌莢膜多糖進行降解，方法如下：

1）將不同的血清型莢膜多糖分別溶于二純水中，制備成濃度為1-2mg/ml的溶液，4℃充分溶解；

2）冰水浴中，用功率為80-100W，頻率為20kHz的超聲波處理溶液；處理時間為10-30min；

3）利用MALLS分析降解后多糖的分子量大小為80KDa-300KDa。

6.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述疫苗制劑為多價疫苗制劑，其中的肺炎鏈球菌莢膜多糖選自血清型為1,3,4,5,6A，6B，7F，9V，14,18C，19A，19F，23F中的幾種肺炎鏈球菌產生的莢膜多糖。

7.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述疫苗制劑為13價疫苗制劑，其中的肺炎鏈球菌莢膜多糖血清型為1,3,4,5,6A，6B，7F，9V，14,18C，19A，19F，23F的肺炎鏈球菌產生的莢膜多糖。

8.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于，制備多價疫苗制劑，則將按照前4步制備得到的各型單價結合物按照比例混合，加入藥用輔料，必要時加入鋁佐劑，制備成多價肺炎多糖蛋白結合疫苗制劑。