[發明專利]一種肺炎鏈球菌莢膜多糖的制備方法

有效

• 申請號: 201210490414.8
• 申請日: 2012-11-26
• 公開（公告）號: CN103833865B
• 公開（公告）日: 2017-06-06
• 發明（設計）人: 金永杰;孫倩;李軍強;趙秋敏;李亞冰;劉賀軍;曹小丹;李靜;李劍
• 申請（專利權）人: 天士力制藥集團股份有限公司
• 主分類號: C08B37/00
• 分類號: C08B37/00;C12P19/04;A61K39/09;A61P31/04;C12R1/46
• 代理公司: 北京華科聯合專利事務所(普通合伙)11130
• 代理人: 王為

技術領域：

本發明涉及疫苗的制備，特別涉及一種肺炎鏈球菌莢膜多糖的制備方法。

背景技術：

肺炎鏈球菌（streptococcus pneumoniae）又名肺炎雙球菌，屬于鏈球菌屬。肺炎鏈球菌可引起多種疾病，主要有肺炎、腦膜炎、菌血癥、中耳炎等。該菌為條件致病菌，正常人的口腔及鼻咽腔內均可形成帶菌狀態，在機體抵抗力下降的時候引起疾病，尤其是老年人、2歲以下兒童以及免疫缺陷或免疫力低下的人群。

保守估計肺炎鏈球菌在發展中國家每年導致100萬以上5歲以下兒童死亡，并且死亡人數中大約20％～25％是該年齡組，甚至在那些很樂意接受有效防止微生物感染理論的發達國家，因肺炎疾病導致的發病率和死亡率也是真實存在的。例如，美國每年大約有500 000例肺炎鏈球菌性肺炎，50 000例菌血癥，3 000例肺炎鏈球菌腦膜炎，它們共導致40 000人死亡。肺炎鏈球菌也是中耳炎流行的唯一致病菌，美國每年有2 400萬人要看兒科醫生，并且比其他傳染病使用了更多的抗生素。因此，中耳炎對發達國家的衛生支出與其它傳染病相比造成了很大的沖擊，估計每年支出要超過50億美元。

肺炎鏈球菌，為革蘭氏陽性菌。其表面附著一層莢膜多糖，對菌體起保護作用，是主要的毒力因子。根據該莢膜的組成差異，已鑒定出約90個不同的肺炎球菌血清型，其中只有約20幾種能引起人類疾病。科學家把這20幾種不同血清型的肺炎球菌的莢膜多糖分別提取出來，制成疫苗用于預防由肺炎鏈球菌引起的各種疾病。目前，成人肺炎疫苗為23價肺炎多糖疫苗，型別包括1、2、3、4、5、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和33F型，在不同國家和地區可覆蓋85%~95%的流行菌株。莢膜多糖為T細胞非依賴性抗原，2歲以下兒童由于免疫系統的不成熟，多糖疫苗只能產生有限的免疫應答，并且沒有免疫記憶反應。將莢膜多糖與載體蛋白結合（即所謂的多糖-蛋白結合疫苗）可使多糖抗原由T細胞非依賴性抗原轉化成T細胞依賴性抗原，有效激發2歲以下兒童的免疫應答，并形成免疫記憶，目前全球上的肺炎多糖-蛋白結合疫苗的主要有7價、10價、13價等幾個產品。但不論哪種肺炎疫苗產品，制備各型別的肺炎多糖均是第一步。

肺炎球菌莢膜多糖是肺炎疫苗的有效組分，現有制備方法很多，但實驗室方法較多，難以應用于工業化，本發明建立了一種肺炎鏈球菌發酵培養方法和一種肺炎鏈球菌莢膜多糖（Pn-Ps）制備的工業化新方法。其特征是：①整個多糖提取過程主要以常規的物理、化學分離方法，避免采用以往文章中經常使用的有機試劑抽提（例如冷酚法、酚-氯仿法等）或酶處理去除多糖樣品中的雜質的方法，最大程度的減少了對操作者的傷害和環境污染；②整個提取過程簡單、易于掌握；③制備的多糖純度高。

發明內容：

本發明提供一種肺炎鏈球菌的發酵培養新工藝，采用該工藝可使培養液中莢膜多糖的產量足夠滿足疫苗生產的需求。另外，本發明還提供一種肺炎鏈球菌莢膜多糖的提取工藝，滅活的培養液經離心、膜分離、分段醇沉、分子篩層析等組合技術從肺炎鏈球菌培養物中提取和純化Pn-Ps，整個莢膜多糖提取過程避免使用有機試劑抽提或酶處理去除雜質的方法，并且所制備的Pn-Ps的化學組成符合歐洲藥典5.0版要求，雜質蛋白、核酸的含量分別在1%以下。

本發明的肺炎鏈球菌莢膜多糖的制備方法，經過以下步驟：

一、肺炎鏈球菌的培養

二、滅活

三、肺炎鏈球菌莢膜粗多糖的提取

四、肺炎鏈球菌莢膜粗多糖的精制。

其中，所述肺炎鏈球菌的培養，包括，采用羊血平板復蘇肺炎鏈球菌；制備肺炎鏈球菌種子液；將種子液接種到發酵罐中經培養獲得含有Pn-Ps的培養液。

其中，所述滅活，包括使用常規方法對活的菌體進行滅活，如使用滅活劑對培養液中的肺炎鏈球菌進行滅活。

其中，所述肺炎鏈球菌莢膜粗多糖的提取，包括，發酵液通過連續流或者杯式離心機離心后，采用中空纖維或深層濾器等方式進一步澄清處理；經過澄清之后的發酵液用100kDa 超濾膜包進行超濾濃縮；濃縮液經兩段醇沉后對沉淀進行復溶。

其中，肺炎鏈球菌莢膜粗多糖的精制，包括，復溶后的溶液采用分子篩層析進行精純；收集的樣品溶液采用30kDa超濾膜包脫鹽并濃縮，冷凍干燥獲得精制多糖。