[發(fā)明專利]一種肺炎鏈球菌莢膜多糖的制備方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210490414.8
• 申請日: 2012-11-26
• 公開（公告）號: CN103833865B
• 公開（公告）日: 2017-06-06
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 金永杰;孫倩;李軍強(qiáng);趙秋敏;李亞冰;劉賀軍;曹小丹;李靜;李劍
• 申請（專利權(quán)）人: 天士力制藥集團(tuán)股份有限公司
• 主分類號: C08B37/00
• 分類號: C08B37/00;C12P19/04;A61K39/09;A61P31/04;C12R1/46
• 代理公司: 北京華科聯(lián)合專利事務(wù)所(普通合伙)11130
• 代理人: 王為

1.一種肺炎鏈球菌莢膜多糖的制備方法，該方法包括以下步驟，肺炎鏈球菌的培養(yǎng)，滅活，肺炎鏈球菌莢膜粗多糖的提取，肺炎鏈球菌莢膜粗多糖的精制，其特征在于，

所述肺炎鏈球菌的培養(yǎng)，方法如下：

攪拌式發(fā)酵罐接種后，pH控制在6.5-8.0，轉(zhuǎn)速50-200r/min，培養(yǎng)開始階段采用從發(fā)酵罐底部通壓縮氣體，溶氧量控制在1-10％，當(dāng)發(fā)酵液菌濃達(dá)到0.5-1時，改變通氣方式為從發(fā)酵罐的頂部通壓縮氣體，溶氧控制在0.01-2％，當(dāng)發(fā)酵液菌濃達(dá)到2-2.5時，適量補(bǔ)充碳源，繼續(xù)培養(yǎng)至菌體生長的平臺期后滅活菌體；

所述肺炎鏈球菌莢膜粗多糖的提取，方法如下：

a、取滅活后的肺炎鏈球菌培養(yǎng)液，去除菌體、菌體碎片及培養(yǎng)液中的小分子成分，得濃縮液；

b、濃縮液緩慢加入乙醇至終濃度為15-35％后，2-8℃靜置過夜；

c、所得靜置液離心去除沉淀，上清繼續(xù)加乙醇至終濃度為60-90％后，2-8℃靜置過夜；

d、所得靜置液離心收集沉淀，沉淀用水或NaCl溶液復(fù)溶后，離心去除沉淀，所得上清即為粗糖溶液；

所述肺炎鏈球菌莢膜粗多糖的精制，方法如下：

所得粗糖溶液，采用分子篩排阻層析分離，按照各個型別的肺炎多糖在歐洲藥典5.0版中的標(biāo)準(zhǔn)收集大分子多糖；分離后的多糖采用30kDa超濾膜包脫鹽，再經(jīng)冷凍干燥后即得肺炎鏈球菌莢膜多糖。

2.如權(quán)利要求1中所述的制備方法，其特征在于，所述肺炎鏈球菌莢膜粗多糖的提取，步驟如下：

a、取滅活后的肺炎鏈球菌培養(yǎng)液，去除菌體、菌體碎片、培養(yǎng)液中顆粒性物質(zhì)及小分子成分，得濃縮液；

b、濃縮液緩慢加入乙醇至終濃度為20-30％后，2-8℃靜置過夜；

c、所得靜置液離心去除沉淀，上清繼續(xù)加乙醇至終濃度為75-85％后，2-8℃靜置過夜；

d、所得靜置液離心收集沉淀，沉淀用水或NaCl溶液復(fù)溶后，離心去除沉淀，所得上清即為粗糖溶液。

3.如權(quán)利要求1中所述的制備方法，其特征在于，所述肺炎鏈球菌莢膜粗多糖的提取，步驟如下：

a、取滅活的菌體后肺炎鏈球菌培養(yǎng)液，采用15000g離心30min去除菌體及菌體碎片，上清液進(jìn)一步采用微濾或深層過濾的方式去除殘余的顆粒性物質(zhì)；澄清后的溶液采用100kDa的超濾系統(tǒng)濃縮并去除培養(yǎng)液中的小分子成分，最終得濃縮液；

b、濃縮液緩慢加入乙醇至終濃度為25％后，2-8℃靜置過夜；

c、所得靜置液離心去除沉淀，上清繼續(xù)加乙醇至終濃度為80％后，2-8℃靜置過夜；

d、所得靜置液15000g離心30min收集沉淀，沉淀采用0.2M NaCl溶液復(fù)溶，復(fù)溶液15000g，離心30min去除沉淀得上清，即為粗多糖溶液。

4.如權(quán)利要求1中所述的制備方法，其特征在于，分子篩排阻層析所用填料選自：Sepharose CL-2B、Sepharose CL-4B、Sephacryl S-200、Sepharose 4Fast Flow或Superdex 200；按照各個型別的肺炎多糖在歐洲藥典5.0版中的標(biāo)準(zhǔn)收集大分子多糖；分離后的多糖采用30kDa超濾膜包脫鹽，再經(jīng)冷凍干燥后即得肺炎鏈球菌莢膜多糖。

5.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述肺炎鏈球菌的培養(yǎng)，步驟如下：攪拌式發(fā)酵罐接種后，pH控制在7-7.5，轉(zhuǎn)速70-150r/min，培養(yǎng)開始階段采用從發(fā)酵罐底部通壓縮氣體，溶氧量控制在3-7％，當(dāng)發(fā)酵液菌濃達(dá)到0.5-1時，改變通氣方式為從發(fā)酵罐的頂部通壓縮氣體，溶氧控制在0.1-1.0％，當(dāng)發(fā)酵液菌濃達(dá)到2-2.5時，適量補(bǔ)充碳源，繼續(xù)培養(yǎng)至菌體生長的平臺期后滅活菌體。

6.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述肺炎鏈球菌的培養(yǎng)，步驟如下：攪拌式發(fā)酵罐接種后，培養(yǎng)溫度37℃±2℃，pH維持在7.2±0.2，轉(zhuǎn)速100r/min，轉(zhuǎn)速培養(yǎng)開始階段采用從發(fā)酵罐底部通壓縮氣體，溶氧量控制在5％，當(dāng)發(fā)酵液菌濃達(dá)到0.5-1時，改變通氣方式為從發(fā)酵罐的頂部通壓縮氣體，溶氧控制在0.2％，當(dāng)發(fā)酵液菌濃達(dá)到2-2.5時，適量補(bǔ)充碳源，繼續(xù)培養(yǎng)至菌體生長的平臺期后滅活菌體。