[發(fā)明專利]傳染病病原體全人源化抗體的制備方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210489839.7
• 申請日: 2012-11-27
• 公開（公告）號: CN103045607A
• 公開（公告）日: 2013-04-17
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 李福勝
• 申請（專利權(quán)）人: 李福勝
• 主分類號: C12N15/13
• 分類號: C12N15/13;C12N15/63;C07K16/08;C07K16/10;C07K16/12;C07K16/20
• 代理公司: 鄭州大通專利商標(biāo)代理有限公司 41111
• 代理人: 樊羿

技術(shù)領(lǐng)域

?本發(fā)明涉及抗體的制備技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種傳染病病原體全人源化抗體的制備方法。

背景技術(shù)

?單抗藥物發(fā)展經(jīng)歷了鼠源性單抗，嵌合性單抗、人源化單抗和全人源化單抗四個階段。1975年德國學(xué)者Kohler和英國學(xué)者M(jìn)ilstein將小鼠骨髓瘤細(xì)胞和經(jīng)綿羊紅細(xì)胞免疫的小鼠脾細(xì)胞在體外進(jìn)行兩種細(xì)胞融合，形成雜交瘤（hybridoma）細(xì)胞，這種細(xì)胞繼承兩種親代細(xì)胞的特性，既具有骨髓瘤細(xì)胞無限繁殖的特性，又具有合成和分泌抗體的能力。用這種來源于單個融合細(xì)胞增殖的細(xì)胞群，可制備針對一種抗原決定簇的特異單克隆抗體。經(jīng)過雜交瘤技術(shù)得到的鼠源性抗體，用于人體治療時存在一些問題。首先，由于鼠源性單抗對于人體是異種蛋白，因此，應(yīng)用于人體后，很容易引發(fā)針對異種蛋白的免疫反應(yīng)，影響單抗的治療效果。其次，鼠單抗通常不能有效地激活人體的生物效應(yīng)功能，如補體依賴的細(xì)胞毒(CDCC)及抗體依賴的細(xì)胞毒(ADCC)作用。此外，鼠單抗在人體內(nèi)的半壽期也比較短。這些都限制了鼠源性單抗的治療作用。人源化的抗體可以解決這些問題，通過用DNA?重組技術(shù)將鼠單抗的輕、重鏈可變區(qū)基因插入含有人抗體恒定區(qū)的表達(dá)載體中而構(gòu)建的嵌合抗體，其人源化程度達(dá)到70%左右。表面重塑抗體是通過對鼠抗體表面氨基酸殘基進(jìn)行人源化改造而構(gòu)建。該方法的原則是僅替換與人抗體表面氨基酸殘基（surface?amino?acidresidues，SAR）差別明顯的區(qū)域，在維持抗體活性并兼顧減少異源性基礎(chǔ)上選用與人抗體SAR?相似的氨基酸替換。重構(gòu)抗體通過將異源抗體中的抗原結(jié)合相關(guān)殘基與人抗體重新拼接而構(gòu)建，包括互補決定區(qū)（CDR）移植，部分CDR?移植和特定決定區(qū)（SDR）轉(zhuǎn)移。近年來最有希望的是全人抗體，即抗體的輕重鏈都是來源于人的抗體。目前比較成熟的獲得全人抗體技術(shù)是抗體庫篩選技術(shù)，主要包括噬菌體抗體庫和核糖體展示技術(shù)。目前噬菌體抗體庫技術(shù)也存在不足之處,?如從未經(jīng)免疫動物的抗體庫獲得的抗體親和力不高、受外源基因轉(zhuǎn)化率的限制、抗體庫的庫容不足以涵蓋一些動物的抗體多樣性等；而對于核糖體展示技術(shù)而言，如何進(jìn)一步地提高該系統(tǒng)的穩(wěn)定性，特別是如何防止mRNA的降解和形成穩(wěn)固的蛋白質(zhì)-核糖體-mRNA三聚體無疑是該技術(shù)的關(guān)鍵問題，如何提高大分子蛋白質(zhì)在核糖體上的展示也是未來研究需要關(guān)注的問題。

發(fā)明內(nèi)容

?本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種篩選時間短，成本低，無需免疫的傳染病病原體全人源化抗體的制備方法。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用了以下技術(shù)方案：

首先從傳染病患者或疫苗免疫者外周血分離單核細(xì)胞，通常采用密度梯度離心純化；當(dāng)B細(xì)胞數(shù)量較低時，可采用抗CD19磁珠富集B細(xì)胞；重組抗原蛋白在真核或原核細(xì)胞中生產(chǎn)純化，純化后的抗原蛋白可直接耦合到熒光素異硫氰酸酯（FITC），藻紅蛋白（PE），別藻藍(lán)蛋白（APC）或生物素；之后在低溫下與B細(xì)胞特異性的結(jié)合；最后以流式細(xì)胞儀分離單個標(biāo)記的B細(xì)胞于96孔板中。或者從傳染病患者或疫苗免疫者外周血分離出單核細(xì)胞并純化后不對抗原特異性B細(xì)胞進(jìn)行任何標(biāo)記，由流式細(xì)胞儀直接分離出單個B細(xì)胞于96孔板中，而B細(xì)胞的抗原特異性采用其它方法鑒定，如收集上清液測定抗體中和活性等。

其次，RT-PCR擴(kuò)增重鏈和輕鏈的可變區(qū)基因。例如，cDNA合成在96孔板15ul反應(yīng)體系中進(jìn)行，采用150納克的隨機六聚體引物，0.5微升的10mM的dNTP混合物，及50?U逆轉(zhuǎn)錄酶，反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)在42℃下進(jìn)行10分鐘，25℃下為10分鐘，50℃?60分鐘，最后94℃?5分鐘；IgH，Igλ和Igκ輕鏈可變區(qū)基因采用巢式PCR分別擴(kuò)增，PCR反應(yīng)在96孔板50微升體系中，每孔含20?nM的每個引物或引物組合（所用系列引物的序列如表1所示），300?nM?dNTP和1.2?U?HotStar?Taq?DNA聚合酶。HotStar?Taq?DNA聚合酶錯誤率低，適用于單細(xì)胞的低拷貝模板的擴(kuò)增。巢式PCR擴(kuò)增45個循環(huán)，94℃?30秒，59℃?30秒，72℃下為55秒。