[發(fā)明專利]傳染病病原體全人源化抗體的制備方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210489839.7
• 申請日: 2012-11-27
• 公開（公告）號: CN103045607A
• 公開（公告）日: 2013-04-17
• 發(fā)明（設計）人: 李福勝
• 申請（專利權）人: 李福勝
• 主分類號: C12N15/13
• 分類號: C12N15/13;C12N15/63;C07K16/08;C07K16/10;C07K16/12;C07K16/20
• 代理公司: 鄭州大通專利商標代理有限公司 41111
• 代理人: 樊羿

1.一種傳染病病原體全人源化抗體的制備方法，包括以下步驟：

（1）傳染病病原體抗原的制備：以常規(guī)方法在真核或原核細胞中生產(chǎn)并純化重組傳染病病原體抗原蛋白；

（2）抗體的標記：將上步純化的重組傳染病病原體抗原蛋白以熒光或生物素標記；

（3）B細胞的獲取、富集與純化：從傳染病患者或疫苗免疫者外周血分離單核的B細胞，采用密度梯度離心純化；

（4）標記抗原與特異性B細胞的結合：將步驟（2）中標記的重組傳染病病原體抗原蛋白與步驟（3）中的B細胞進行特異性結合；

（5）抗原特異性B細胞的獲取：根據(jù)標記，以流式細胞儀篩選、分離出上步中抗原特異性的單個B細胞，即單個標記的B細胞；

（6）擴增抗體可變區(qū)基因：采用核苷酸序列如SEQ?ID?NO:1～SEQ?ID?NO:58所示系列特異性的混合引物，應用單細胞巢式RT-PCR從所述單個標記的B細胞中克隆輕鏈和重鏈的可變區(qū)基因；

（7）構建表達載體：將上步所克隆的輕鏈和重鏈可變區(qū)基因插入包含人輕鏈和重鏈恒定區(qū)基因的載體，構建人源抗體真核高效表達載體，成功連接后轉化活化的大腸桿菌株，培養(yǎng)含有正確克隆的細菌，離心收集細菌并采用質粒DNA純化試劑盒純化表達載體DNA；

（8）重組抗體表達與純化：以上步純化后的表達載體DNA轉染真核細胞，培養(yǎng)使其獲得表達后經(jīng)分離純化得重組抗體。

2.一種傳染病病原體全人源化抗體的制備方法，包括以下步驟：

（1）外周血B細胞的富集與純化：從傳染病患者或疫苗免疫者外周血分離單核細胞，采用密度梯度離心純化；

（2）B細胞分離：由流式細胞儀直接分離單個B細胞；

（3）B細胞特異性鑒定：對流式細胞儀單個B細胞的上清液首先進行功能性的鑒定，篩選出具備特異性的單個B細胞；

（4）擴增抗體可變區(qū)基因：采用一系列特異性的混合引物，應用單細胞巢式RT-PCR從上述具備特異性的單個B細胞中克隆輕鏈和重鏈的可變區(qū)基因；

（5）構建表達載體：將上步所克隆的輕鏈和重鏈可變區(qū)基因插入包含人輕鏈和重鏈恒定區(qū)基因的載體，構建人源抗體真核高效表達載體，成功連接后轉化活化的大腸桿菌株，培養(yǎng)含有正確克隆的細菌，離心收集細菌并采用質粒DNA純化試劑盒純化表達載體DNA；

（6）重組抗體表達與純化：以上步純化后的表達載體DNA轉染真核細胞，培養(yǎng)使其獲得表達后經(jīng)分離純化得重組抗體。

3.根據(jù)權利要求1或2所述的傳染病病原體全人源化抗體的制備方法，其特征在于，在權利要求1所述步驟（3）或權利要求2所述步驟（1）中，當B細胞數(shù)量較低時，采用抗CD19磁珠富集B細胞。

4.根據(jù)權利要求1或2所述的傳染病病原體全人源化抗體的制備方法，其特征在于，權利要求1所述步驟（6）或權利要求2所述步驟（4）的具體操作過程為：cDNA合成在96孔板15ul反應體系中進行，采用150納克的隨機六聚體引物、0.5微升的10mM的dNTP混合物及50?U逆轉錄酶，反轉錄反應在42℃下進行10分鐘，25℃下為10分鐘，50℃?60分鐘，最后94℃?5分鐘；IgH,?Igλ和Igκ輕鏈可變區(qū)基因采用巢式PCR分別擴增，PCR反應在96孔板50微升體系中，每孔含20nM的每個引物或引物組合，300?nM?dNTP和1.2?U?HotStar?Taq?DNA聚合酶，巢式PCR擴增45個循環(huán)，94℃?30秒，59℃?30秒，72℃下為55秒。

5.根據(jù)權利要求1或2所述的傳染病病原體全人源化抗體的制備方法，其特征在于，權利要求1所述步驟（7）或權利要求2所述步驟（5）的具體操作過程為：在克隆之前，對上步所得PCR產(chǎn)物首先采用PCR純化試劑盒進行純化，之后采用相應的限制性內(nèi)切酶消化，然后克隆入含有多克隆位點的Igγ，Igκ或Igλ輕鏈的恒定區(qū)的載體中，連接反應的總體積為10微升，含1?U?T4?DNA連接酶，7.5微升純化的PCR產(chǎn)物和25?ng的線性化載體，成功連接后轉化活化的大腸桿菌株，含有正確克隆的細菌在培養(yǎng)液中培養(yǎng)16小時，離心收集細菌采用質粒DNA純化試劑盒純化DNA。