[發明專利]傳染病病原體全人源化抗體的制備方法

無效

• 申請號: 201210489839.7
• 申請日: 2012-11-27
• 公開（公告）號: CN103045607A
• 公開（公告）日: 2013-04-17
• 發明（設計）人: 李福勝
• 申請（專利權）人: 李福勝
• 主分類號: C12N15/13
• 分類號: C12N15/13;C12N15/63;C07K16/08;C07K16/10;C07K16/12;C07K16/20
• 代理公司: 鄭州大通專利商標代理有限公司 41111
• 代理人: 樊羿

1.一種傳染病病原體全人源化抗體的制備方法，包括以下步驟：

（1）傳染病病原體抗原的制備：以常規方法在真核或原核細胞中生產并純化重組傳染病病原體抗原蛋白；

（2）抗體的標記：將上步純化的重組傳染病病原體抗原蛋白以熒光或生物素標記；

（3）B細胞的獲取、富集與純化：從傳染病患者或疫苗免疫者外周血分離單核的B細胞，采用密度梯度離心純化；

（4）標記抗原與特異性B細胞的結合：將步驟（2）中標記的重組傳染病病原體抗原蛋白與步驟（3）中的B細胞進行特異性結合；

（5）抗原特異性B細胞的獲取：根據標記，以流式細胞儀篩選、分離出上步中抗原特異性的單個B細胞，即單個標記的B細胞；

（6）擴增抗體可變區基因：采用核苷酸序列如SEQ?ID?NO:1～SEQ?ID?NO:58所示系列特異性的混合引物，應用單細胞巢式RT-PCR從所述單個標記的B細胞中克隆輕鏈和重鏈的可變區基因；

（7）構建表達載體：將上步所克隆的輕鏈和重鏈可變區基因插入包含人輕鏈和重鏈恒定區基因的載體，構建人源抗體真核高效表達載體，成功連接后轉化活化的大腸桿菌株，培養含有正確克隆的細菌，離心收集細菌并采用質粒DNA純化試劑盒純化表達載體DNA；

（8）重組抗體表達與純化：以上步純化后的表達載體DNA轉染真核細胞，培養使其獲得表達后經分離純化得重組抗體。

2.一種傳染病病原體全人源化抗體的制備方法，包括以下步驟：

（1）外周血B細胞的富集與純化：從傳染病患者或疫苗免疫者外周血分離單核細胞，采用密度梯度離心純化；

（2）B細胞分離：由流式細胞儀直接分離單個B細胞；

（3）B細胞特異性鑒定：對流式細胞儀單個B細胞的上清液首先進行功能性的鑒定，篩選出具備特異性的單個B細胞；

（4）擴增抗體可變區基因：采用一系列特異性的混合引物，應用單細胞巢式RT-PCR從上述具備特異性的單個B細胞中克隆輕鏈和重鏈的可變區基因；

（5）構建表達載體：將上步所克隆的輕鏈和重鏈可變區基因插入包含人輕鏈和重鏈恒定區基因的載體，構建人源抗體真核高效表達載體，成功連接后轉化活化的大腸桿菌株，培養含有正確克隆的細菌，離心收集細菌并采用質粒DNA純化試劑盒純化表達載體DNA；

（6）重組抗體表達與純化：以上步純化后的表達載體DNA轉染真核細胞，培養使其獲得表達后經分離純化得重組抗體。

3.根據權利要求1或2所述的傳染病病原體全人源化抗體的制備方法，其特征在于，在權利要求1所述步驟（3）或權利要求2所述步驟（1）中，當B細胞數量較低時，采用抗CD19磁珠富集B細胞。

4.根據權利要求1或2所述的傳染病病原體全人源化抗體的制備方法，其特征在于，權利要求1所述步驟（6）或權利要求2所述步驟（4）的具體操作過程為：cDNA合成在96孔板15ul反應體系中進行，采用150納克的隨機六聚體引物、0.5微升的10mM的dNTP混合物及50?U逆轉錄酶，反轉錄反應在42℃下進行10分鐘，25℃下為10分鐘，50℃?60分鐘，最后94℃?5分鐘；IgH,?Igλ和Igκ輕鏈可變區基因采用巢式PCR分別擴增，PCR反應在96孔板50微升體系中，每孔含20nM的每個引物或引物組合，300?nM?dNTP和1.2?U?HotStar?Taq?DNA聚合酶，巢式PCR擴增45個循環，94℃?30秒，59℃?30秒，72℃下為55秒。

5.根據權利要求1或2所述的傳染病病原體全人源化抗體的制備方法，其特征在于，權利要求1所述步驟（7）或權利要求2所述步驟（5）的具體操作過程為：在克隆之前，對上步所得PCR產物首先采用PCR純化試劑盒進行純化，之后采用相應的限制性內切酶消化，然后克隆入含有多克隆位點的Igγ，Igκ或Igλ輕鏈的恒定區的載體中，連接反應的總體積為10微升，含1?U?T4?DNA連接酶，7.5微升純化的PCR產物和25?ng的線性化載體，成功連接后轉化活化的大腸桿菌株，含有正確克隆的細菌在培養液中培養16小時，離心收集細菌采用質粒DNA純化試劑盒純化DNA。