[發(fā)明專(zhuān)利]一種提取及培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210488783.3
• 申請(qǐng)日: 2012-11-27
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103060269A
• 公開(kāi)（公告）日: 2013-04-24
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王泰華;李榮榮;孫濤
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 山東新醫(yī)學(xué)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)學(xué)研究院有限公司
• 主分類(lèi)號(hào): C12N5/0775
• 分類(lèi)號(hào): C12N5/0775
• 代理公司: 暫無(wú)信息
• 代理人: 暫無(wú)信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是指一種提取及培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞的方法。

背景技術(shù)

間充質(zhì)干細(xì)胞最初在骨髓中發(fā)現(xiàn)，目前已經(jīng)可以從多種組織中分離出間充質(zhì)干細(xì)胞，包括骨膜、松質(zhì)骨、脂肪、滑膜、骨骼肌、胎肝、乳牙、臍帶、臍帶血中等，因其具有多向分化潛能、支持造血和促進(jìn)干細(xì)胞植入、免疫調(diào)控和自我復(fù)制等特點(diǎn)而日益受到人們的關(guān)注。自從2001年發(fā)現(xiàn)脂肪來(lái)源干細(xì)胞以來(lái)，由于其具有數(shù)量巨大，對(duì)患者損傷較小，獲取相對(duì)容易，更重要的是脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞不易受到腫瘤細(xì)胞污染，更容易進(jìn)行體外凈化，病人可以用自體細(xì)胞，并且移植細(xì)胞更易被患者自身組織所接受，更快的整合到自身組織系統(tǒng)以發(fā)揮作用，克服來(lái)自骨髓或者臍帶血所存在諸如難以收集、成本高以及必須通過(guò)組織相容性驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)合適匹配的缺陷，同時(shí)避免了一系列的倫理問(wèn)題和異體細(xì)胞的免疫排斥等移植副反應(yīng)，所以在臨床應(yīng)用上有極大的優(yōu)勢(shì)和廣闊的前景。

目前，從脂肪組織提取間充質(zhì)干細(xì)胞一般通過(guò)水浴酶消化30～60分鐘，一次性離心收集單個(gè)核細(xì)胞，并進(jìn)行貼壁培養(yǎng)去除紅細(xì)胞等非貼壁細(xì)胞，從而得到較純的間充質(zhì)干細(xì)胞，然而，這種一次性酶消化得到的間充質(zhì)干細(xì)胞的數(shù)量和質(zhì)量往往不能同時(shí)保證，消化時(shí)間過(guò)短不能從組織中完全解離單個(gè)干細(xì)胞，消化時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，最初解離出的單個(gè)干細(xì)胞受到消化酶的過(guò)渡作用，對(duì)細(xì)胞狀態(tài)造成傷害，最終得到的間充質(zhì)干細(xì)胞狀態(tài)好壞不均，為了防止消化酶的過(guò)度作用以得到良好的勻質(zhì)細(xì)胞就必須通過(guò)對(duì)大量的脂肪組織(一般需要200ml以上)短時(shí)間作用，因此，為了保證從脂肪中成功提取間充質(zhì)干細(xì)胞需要大量的脂肪組織，這就需要通過(guò)無(wú)菌條件下濕性抽脂法抽取200ml以上脂肪，抽脂過(guò)程中需要大面積的局部麻醉，并在抽脂部位切一個(gè)口，導(dǎo)致患者抽脂面積較大，手術(shù)時(shí)間較長(zhǎng)，出血較多或?qū)е掳l(fā)熱現(xiàn)象，如果后期護(hù)理不好容易引發(fā)炎癥對(duì)病人造成一定的創(chuàng)傷和痛苦。所以急需改進(jìn)脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的提取技術(shù)，減少脂肪組織的用量，以減少抽脂過(guò)程對(duì)病人造成的痛苦。

目前，間充質(zhì)干細(xì)胞體外擴(kuò)增培養(yǎng)體系中一般都含有一定濃度的胎牛血清，使用濃度至少10％才能保證細(xì)胞的正常生長(zhǎng)傳代。然而，間充質(zhì)干細(xì)胞在高濃度血清培養(yǎng)時(shí)，隨著傳代次數(shù)增加，細(xì)胞增殖能力下降，形態(tài)由長(zhǎng)梭形變?yōu)閷挻蟊馄剑饾u喪失多向分化能力。另外，動(dòng)物血清可能存在動(dòng)物攜帶的潛在病毒或支原體污染，對(duì)以后可能的臨床應(yīng)用構(gòu)成威脅。盡管研究人員嘗試了很多的無(wú)血清培養(yǎng)基方案，但間充質(zhì)干細(xì)胞在無(wú)血清培養(yǎng)基中普遍存在生長(zhǎng)緩慢，多向分化能力逐漸消失的問(wèn)題，為了提高細(xì)胞的增殖速度必須通過(guò)添加大量的非血清添加劑，例如CNI02634482A(專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?01210010246.8，申請(qǐng)公布日2012.08.15)添加了近十種成分，完全培養(yǎng)基的配置費(fèi)時(shí)費(fèi)力，且培養(yǎng)狀態(tài)容易受單一成分的影響，至今無(wú)血清培養(yǎng)基仍未能獲得重大突破。所以，急需開(kāi)發(fā)一種安全、穩(wěn)定、快速、高質(zhì)量擴(kuò)增間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)體系。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明提出一種提取及培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，解決了現(xiàn)有技術(shù)必須從200ml以上脂肪組織才能提取干細(xì)胞的問(wèn)題，大大降低了提取成本，同時(shí)將病人的創(chuàng)傷降到接近零，二是避免了使用胎牛血清帶來(lái)的各種弊端，且解決了現(xiàn)有技術(shù)中完全培養(yǎng)基的配置費(fèi)時(shí)費(fèi)力，且培養(yǎng)狀態(tài)容易受單一成分的影響，質(zhì)量低的問(wèn)題。

本發(fā)明的技術(shù)方案是這樣實(shí)現(xiàn)的：一種提取及培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，包括下列步驟：

1)將150～250ml血液，放在肝素鈉抗凝管中，在2～8℃保存；

2)將上述制得的抗凝血1500～2100r/min離心8～12min，血液分層，取上層液體部分得到富含血小板的血漿，將所述富含血小板的血漿在2～8℃下保存1～7天備用或在-75～-85℃下長(zhǎng)期保存?zhèn)溆茫?/p>

3)將5～10mL的脂肪組織靜置8～12min后分層，移除下層紅細(xì)胞聚集區(qū)的液體；

4)用添加有抗生素的磷酸鹽緩沖液30～40ml重懸脂肪組織，1200～1800r/min離心3～7min洗滌上述去除紅細(xì)胞后的脂肪組織一次；

5)用質(zhì)量濃度為0.05～0.15％的I型膠原酶懸浮上述洗滌后的脂肪組織，其中所述膠原酶和所述洗滌后的脂肪組織的體積比為1.5∶1～2.5∶1，混勻后置于37℃水浴中消化，開(kāi)始計(jì)時(shí)，并每隔1～3分鐘振蕩該懸液；