[發明專利]一種提取及培養間充質干細胞的方法

有效

• 申請號: 201210488783.3
• 申請日: 2012-11-27
• 公開（公告）號: CN103060269A
• 公開（公告）日: 2013-04-24
• 發明（設計）人: 王泰華;李榮榮;孫濤
• 申請（專利權）人: 山東新醫學中西醫結合醫學研究院有限公司
• 主分類號: C12N5/0775
• 分類號: C12N5/0775
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種提取及培養間充質干細胞的方法，其特征在于，包括下列步驟：

1)將150～250ml血液，放在肝素鈉抗凝管中，在2～8℃保存；

2)將上述制得的抗凝血1500～2100r/min離心8～12min，血液分層，取上層液體部分得到富含血小板的血漿，將所述富含血小板的血漿在2～8℃下保存1～7天備用或在-75～-85℃下長期保存備用；

3)將5～10mL的脂肪組織靜置8～12min后分層，移除下層紅細胞聚集區的液體；

4)用添加有抗生素的磷酸鹽緩沖液30～40ml重懸脂肪組織，1200～1800r/min離心3～7min洗滌上述去除紅細胞后的脂肪組織一次；

5)用質量濃度為0.05～0.15％的I型膠原酶懸浮上述洗滌后脂肪組織，其中所述膠原酶和所述洗滌后的脂肪組織的體積比為1.5∶1～2.5∶1，混勻后置于37℃水浴中消化，開始計時，并每隔1～3分鐘振蕩該懸液；

6)上述消化18～22min后，加磷酸鹽緩沖液20～30ml稀釋，1400～1600r/min離心3～7min，未消化好的脂肪組織聚集在上層，吸出未消化好的脂肪組織重復步驟(5)；消化下來的單個細胞沉淀在離心管底部，將中間層液體倒出，下層沉淀加DMEM懸浮，100目篩網過濾去除雜質，1300～1700r/min離心4～8min，棄上清液，底部細胞加入8～12ml的DMEM培養基，吹打均勻；

7)將步驟6)中第二次消化的脂肪組織于消化后13～17min，加磷酸鹽緩沖液20～30ml稀釋，1400～1600r/min離心3～7min，未消化好的脂肪組織聚集在上層，吸出未消化好的脂肪組織重復步驟(5)；消化下來的單個細胞沉淀在離心管底部，將中間層液體倒出，下層沉淀加DMEM懸浮，100目篩網過濾去除雜質，1300～1700r/min離心4～8min，棄上清液，底部細胞加入8～12ml的DMEM培養基，吹打均勻；

8)將步驟7)中第三次消化的脂肪組織于消化后8～12min，加磷酸鹽緩充液20～30ml稀釋，1400～1600r/min離心5～7min，倒掉上層脂肪油滴和液體，下層沉淀加DMEM懸浮，100目篩網過濾去除雜質，1400～1600r/min離心5～7min，底部細胞加入8～12ml的DMEM培養基，吹打均勻；

9)將步驟6)、7)和8)中收集的細胞懸液匯合，1400～1600r/min離心4～6min；棄上清液，加入完全培養基吹打均勻，臺盼藍染色，用計數板計數后，按1×10⁵/mL的密度接種于25cm²培養瓶中，在37℃、體積含量5％CO₂、95％濕度條件下培養；

10)培養24～48小時后，收集培養瓶中1/2的細胞培養基1400～1600r/min離心4～6min，紅細胞沉淀在離心管底部，收集上層培養基并按1∶1的比例添加新配制的完全培養基以替代培養瓶中剩余1/2的培養基完，以后每2～3.5天換液，記為P0代。

2.如權利要求1所述的一種提取及培養間充質干細胞的方法，其特征在于：所述磷酸鹽緩沖液PH為7～7.4，并且所述磷酸鹽緩沖液中不含有Ca²⁺和Mg²⁺。

3.如權利要求1所述的一種提取及培養間充質干細胞的方法，其特征在于：步驟5)中所述膠原酶和所述洗滌后的脂肪組織的體積比為2∶1。

4.如權利要求1所述的一種提取及培養間充質干細胞的方法，其特征在于：將培養的所述P0代細胞達到80～90％匯合時，以質量濃度0.25％的胰酶和質量濃度0.02％的EDTA消化細胞，按1∶3比例傳代到75cm²培養瓶中，并標記為P1，8ml培養基/瓶，第二天按4ml原培養基：7ml新培養基的比例換液，最終總培養基達12ml，擴增用培養基：基礎培養基α-MEM，含有5％的富含血小板的血漿、10ng/ml的堿性成纖維細胞生長因子、0.5μg/ml慶大霉素，從P1代開始傳代采用高比例傳代方法：從原來的1∶3改為1∶6，并換用細胞工廠進行培養。

5.如權利要求4所述的一種提取及培養間充質干細胞的方法，其特征在于：所述細胞工廠為Corning的多層細胞培養器。

6.如權利要求1所述的一種提取及培養間充質干細胞的方法，其特征在于：所述完全培養基為基礎培養基α-MEM，含有5％的富含血小板的血漿、10ng/ml的堿性成纖維細胞生長因子、0.5μg/ml慶大霉素。