[發明專利]具有血管化能力的組織工程骨及其制備方法

無效

• 申請號: 201210488049.7
• 申請日: 2012-11-27
• 公開（公告）號: CN103007360A
• 公開（公告）日: 2013-04-03
• 發明（設計）人: 段春光;劉建;孟國林
• 申請（專利權）人: 段春光
• 主分類號: A61L27/54
• 分類號: A61L27/54;A61L27/24
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及工程骨(人工骨)制造技術領域，尤其涉及的是一種具有血管化能力的組織工程骨及其制備方法。

背景技術

大段骨缺損的修復是臨床面臨的一大難題，目前尚未得到很好地解決。近年來組織工程的發展有望成為治療大段骨缺損的新方法，但目前組織工程化的人工骨用于大段骨缺損的治療時有一個關鍵性的問題尚未克服，即人工骨血管化的問題。但目前的人工骨由于不能解決自身血管化的問題，至使其無法有效修復大段的骨缺損。

發明內容

血管內皮生長因子(VEGF)和血管生成素(Ang-1)是兩個在血管形成及塑型過程中起重要作用的兩個細胞因子，本發明使用這兩個具有高效促血管形成能力的細胞因子與I型膠原改性的多孔支架材料復合，構建新型的雙基因修飾的組織工程化人工骨，以期在采用組織工程化人工骨治療大段骨缺損時能促進人工骨的血管化，進而有效修復大段骨缺損。

本發明的技術方案如下：

一種具有血管化能力的組織工程骨的制備方法，包括以下步驟：A1，VEGF、Ang-1基因質粒的獲取及擴增、純化；

A2，VEGF、Ang-1基因質粒與I型膠原混合溶液的制備；具體方法為：I型膠原蛋白粉末置于0.2mol/L醋酸溶液中，PH＝3.2，配成0.3wt％的I型膠原溶液，4℃中充分攪拌12h，以使其充分溶解；然后將得到的VEGF、Ang-1的質粒與I型膠原溶液混合，質粒濃度按照各20ug/ml配制；

A3，將上述獲得的支架材料在真空環境下置于所述的I型膠原混合溶液中抽吸4h，使原始支架孔洞中充分浸入I型膠原溶液；混合物于-80℃冷凍12h后，在真空凍干機中凍干48-72h以使孔洞中形成膠原海綿結構；37℃下用1％戊二醛溶液對膠原海綿結構進行交聯10min；用去離子水反復洗滌后置于凍干機中凍干，構建成具有雙基因修飾的新型人工骨。

所述的方法，所述步驟A1中，擴增VEGF所用引物對為：

Primer1：GGAAGATCTATGAACTTTCTGCTGTCT；

Primer2：ACGCGTCGACCCGCCTCGGCTTGTCACA；

上游引物Primer1引入Bgl?II位點，下游引物Primer2引入Sal?I位點。

所述的方法，所述步驟A1中，擴增Ang-1基因所用引物對為：首輪PCR引物：

primer3：AGAGGTCAGAAGAAAGGAGCAA；

primer4：GCCCGACAGTCAGTGGAGT；

第二輪PCR引物：

primer5：ATGACAGTTTTCCTTTCCTTTGC；

primer6：TCAAAAATCTAAAGGTCGAATCATC。

將構建的組織工程人工骨用于動物體內節段性骨缺損的修復，具有良好的修復效果。

附圖說明

圖1為細胞在支架材料中的增殖情況(n＝4)；

圖2為X?ray檢測結果；(a)-(d).術后即刻X?ray檢測結果(a)：實驗組A；(b)：實驗組B；(c)：實驗組C；(d)：實驗組D。(e)-(h).術后4w?X?ray檢測結果(e)：實驗組A；(f)：實驗組B；(g)：實驗組C；(h)：實驗組D。(i)-(l).術后8w?X?ray檢測結果(i)：實驗組A；(j)：實驗組B；(k)：實驗組C；(1)：實驗組D。

圖3為術后8w?MciroCT檢測結果；(a)：實驗組A三維重建結果及層面截圖；(b)：實驗組B三維重建結果及層面截圖；(c)：實驗組C三維重建結果及層面截圖；

圖4為術后1w硬組織切片改良麗春紅三色法染色。(a)：實驗組A，(b)實驗組B，(c)實驗組C；

圖5為術后1W硬組織切片CD34染色。(a)：實驗組A，(b)：實驗組B，(c)：實驗組C。

圖6為術后4、8w改良麗春紅三色染色；(a)：A組4w時，(b)：A組8w時，(c)：B組4w時，(d)：B組8w時，(e)：C組4w時，(f)：C組8w時；

圖7為.術后4、8W?H.E.染色。(a)：A組4w時，(b)：A組8w時，(c)：B組4w時，(d)：B組8w時；

具體實施方式

以下結合具體實施例，對本發明進行詳細說明。

實施例1、VEGF、Ang-1質粒的獲取及擴增、純化

1.VEGF的獲取、擴增及純化

1.1引物設計