[發(fā)明專利]一種從蓮蓬中提取多酚氧化酶的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210487120.X
• 申請(qǐng)日: 2012-11-27
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103013937A
• 公開(kāi)（公告）日: 2013-04-03
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 鄧澤元;謝汝朋
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 南昌大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N9/02
• 分類號(hào): C12N9/02
• 代理公司: 南昌新天下專利商標(biāo)代理有限公司 36115
• 代理人: 施秀瑾

1.一種從蓮蓬中提取多酚氧化酶的方法，其特征是按如下步驟：

（1）提取緩沖溶液的制備：在0.1~1.0mol/L?pH?5.0~8.0的磷酸鹽緩沖液中加入Triton?X-100、聚乙二醇和NaCl等破壁劑制得提取緩沖溶液，使該提取緩沖溶液含Triton?X-100?0~5?g/100mL、聚乙二醇0~5?g/100mL、NaCl?0.1~2.0?g/100mL，2℃~5℃冷卻處理；

?(2)取新鮮的或冷凍保藏去籽蓮蓬，撕碎或切片，按照1:1~1:5的料液比（g/ml）加入步驟（1）中的提取緩沖溶液，冰浴或冷凍等低溫環(huán)境下勻漿后，超聲波處理10~20min，漿體在4℃~常溫下靜置20~60min，靜置過(guò)程中攪拌3~5次，過(guò)濾漿體，取清液；所得的清液在4℃~20℃條件下低溫離心10~20min，離心速率為4000g，棄去沉淀，保留上清液，往上清液中緩慢加入(NH₄)₂SO₄固體粉末使其達(dá)到30~40%的飽和度，4℃~20℃低溫條件下離心20~40min，離心速率為8000~13000g，棄去沉淀物，保留上清液；繼續(xù)往上清液中加入固體(NH₄)₂SO₄固體粉末以達(dá)到70~80%的飽和度，4℃~20℃條件下離心30~60min，離心速率為10000~15000g，棄去上清液，保留沉淀物；沉淀物用少量的0.1~1.0mol/L?pH?5.0~8.0的磷酸鹽緩沖液溶解，得到粗提物；

(3)將步驟（2）的粗提物分裝于經(jīng)過(guò)常規(guī)預(yù)處理的截留分子量10~25kDa的透析袋，以水或者0.1~0.3mol/L?pH?5.0~8.0的磷酸鹽緩沖液作為透析液，4℃條件下透析5~20h除鹽；通過(guò)截留分子量10~25kDa的超濾至合適的體積，即得到多酚氧化酶的粗提物；

?(4)將步驟（3）的多酚氧化酶粗提物按照上樣體積：柱床體積=1:10~1:50的比例，經(jīng)過(guò)離子交換樹(shù)脂柱，分別用水和0.2~1.0mol/L的梯度NaCl溶液洗脫；以兒茶素為底物測(cè)定多酚氧化酶的酶活力，收集酶活最高的占體積總量20-30%的洗脫液；再經(jīng)凝膠柱用相同方法的洗脫和收集，得到酶活最高的占體積總量20-30%的洗脫液；用步驟（3）中方法透析處理，經(jīng)過(guò)超濾或冷凍干燥得到純化的多酚氧化酶。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是步驟（1）所述的緩沖溶液中加入了破壁劑。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是步驟（4）所述的離子交換樹(shù)脂柱為DEAE-Sephadex?A-25或DEAE-纖維素。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是步驟（4）所述的凝膠柱為Sephacryl?S-200或Sephadex-G100。