[發明專利]一種表皮細胞抑裂素及其制備方法和應用

有效

• 申請號: 201210485772.X
• 申請日: 2012-11-26
• 公開（公告）號: CN102977203A
• 公開（公告）日: 2013-03-20
• 發明（設計）人: 金以豐;吳奇;馬曉艷;張太平;宣勤貴
• 申請（專利權）人: 南京必優康生物技術有限公司
• 主分類號: C07K14/47
• 分類號: C07K14/47;C07K1/18;C12Q1/02;A61K38/17;A61P17/06;A61P35/00
• 代理公司: 南京知識律師事務所 32207
• 代理人: 胡錫瑜

技術領域

????本發明屬于生化分離純化技術領域，具體涉及一種表皮細胞抑裂素及其制備方法和應用.?

背景技術

表皮細胞抑裂素(簡稱皮抑素)是動物的表皮細胞產生的一種內源性的蛋白質細胞因子，它可以作用于動物的表皮細胞，抑制表皮細胞的有絲分裂使之停留在細胞生長周期的G1期。20世紀初就有人發現生物體內存在抑制細胞分裂的物質，以后有人發現一種組織的抽提液加到同種組織中能抑制該組織細胞的分裂。1960年Bulough和Laurence在研究體內上皮細胞分裂的控制中指出有一個內源性的細胞專一的抑制劑可以阻斷細胞的生長周期，這種抑制劑是由細胞產生的一種內源性物質，在體內起負調控作用，因此提出“Chalone”這一名詞命名這一類物質，指它們在體內起減速或中斷的作用。Chalone由于來源不同，靶細胞不同而有許多種，例如淋巴細胞抑裂素、表皮細胞抑裂素、粒細胞抑裂素、肝細胞抑裂素等。它們都有4方面的共性：（1）有組織特異性（2）無種族特異性（3）無細胞毒性（4）可逆性。鑒于上述特異性，抑素對于一些異常的分裂、增殖應該可以起到抑制作用。顯然具有潛在的應用前景，例如淋巴細胞抑裂素有可能發展為抗排異藥、肝細胞抑裂素有抑制肝癌細胞快速生長的功能、表皮細胞抑裂素具有抑制某些類型銀屑病病人皮屑大量生成的作用。?

發明內容：?

????本發明需要解決的問題是對皮抑素的提取純化，作較大改進使之更適合工業化生產，使工藝更合理、得率更高、質量更好、更穩定。活性使用HaCat人永生化表皮細胞株中位測定法，使操作更方便、科學、可靠性、可比性更強

????本發明的技術方案????

????本發明所述表皮細胞抑裂素由動物皮分離純化,分子量為30000-50000。

?(?1)、表皮細胞抑裂素的制備方法:?取?新鮮豬皮削除所附脂肪組織，洗凈，用絞肉機絞成肉皮糜，稱量重量，加入三倍水用膠體磨將肉皮糜磨成勻漿，攪拌3小時、過濾，濾渣再加入二倍體積水再攪拌2小時，合并二次濾液。濾液脫脂肪，通過截止分子量10000的超濾膜過濾，濃縮至起始體積的3%-5%，將濃縮后超濾保留液用乙醇沉淀，取30%—80%的沉淀部分用PH7.5的磷酸緩沖液溶解，離心取上清。將上清液調至PH酸性此時皮抑素帶正電荷，可以交換至SP—Sepharose離子交換柱上，而大量雜蛋白可以穿過而被洗去，改用PH8.0的磷酸緩沖液洗脫可得洗脫峰1，再改用含0.5?M?NaCl?的PH8.0磷酸緩沖液洗脫可得洗脫峰2（層析結果見圖1），測活性證明活性主要在峰1中，峰2中亦有部分活性SP—Sepharose?F.F?是一種陽離子交換劑，皮抑素在酸性條件下帶正電荷，可以交換在層析柱上，所有帶負電荷的蛋白質不能交換在柱上，都在穿過峰中，被PH6.5的磷酸緩沖液洗脫；然后改用PH8.0的磷酸緩沖液，因為PH8.0高于皮抑素的等電點，皮抑素帶負電荷，因此將大部分皮抑素洗下，再用含0.5M?NaCl?的磷酸緩沖液，由于離子強度增加，其他等電點高的蛋白也被洗脫。活性測定結果：上柱前樣品的比活性為2975u/mg，穿過峰面積很大但比活性很低，只有989u/mg，洗脫峰1面積很小但比活性很高，達到244285u/mg比上柱前提高82倍。洗脫峰2面積較小仍有少部分皮抑素，比活性為62160u/mg。?

????(2)、皮抑素的活性測定：采用HaCat人永生化表皮細胞株（購自上海復祥生物技術有限公司）細胞培養在RPMI1640培養液（含小牛血清10%）中，在37℃、CO2培養箱中培養，待細胞長至鋪滿培養瓶壁的80%左右時用0.25%胰蛋白酶將細胞消化，制成3×10⁴/ml。細胞懸液在96孔培養板中每孔加160μl細胞懸液，培養20小時后加入皮抑素40μl。稀釋依溶液中皮抑素的含量而定，可以從每孔微克水平倍比稀釋至納克或者匹克水平，對照組加40μl培養液。各種濃度做三孔重復，繼續培養72小時后加入5mg/ml?MTT?20μl，再培養4小時，倒去上清加入二甲亞砜100μl顯色，在酶標儀OD492nm處讀數，將三個重復孔的讀數取平均值，與對照組的平均值計算抑制百分率，規定抑制1%為一個活性微單位（mu）。將抑制百分率對每孔的蛋白質濃度做圖，可得一個S型曲線，得上下平臺，取上下平臺的中值為活性點。活性點的蛋白量/孔含有的活性單位稱為比活性（u/mg)，比活性代表皮抑素的純度，比活性高表示皮抑素的活性亦高。?

?比活性（u/mg）=?