[發明專利]一種豬Ⅰ型細環病毒TTSuV1抗體間接ELISA診斷試劑盒及其制備方法

有效

• 申請號: 201210485102.8
• 申請日: 2012-11-23
• 公開（公告）號: CN102998453A
• 公開（公告）日: 2013-03-27
• 發明（設計）人: 李中圣;羅鈞;陳善真;趙焱
• 申請（專利權）人: 廣東現代農業集團研究院有限公司
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577;G01N33/531
• 代理公司: 廣州市越秀區哲力專利商標事務所(普通合伙) 44288
• 代理人: 湯喜友

1.?一種豬Ⅰ型細環病毒TTSuV1抗體間接ELISA診斷試劑盒，其特征在于：其包括用酵母表達的TTSuV1?ORF1a重組蛋白包被抗原包被的酶標板，以及用TTSuV1?ORF1作為免疫診斷抗原篩選出的標準陽性血清和標準陰性血清，其中用酵母表達的TTSuV1?ORF1a重組蛋白的序列為SEQ?ID?NO:1。

2.?根據權利要求1所述的豬Ⅰ型細環病毒TTSuV1抗體間接ELISA診斷試劑盒，其特征在于其還包括

1）HRP?標記的兔抗豬二抗液：兔抗豬二抗與HRP保護液按照體積比為1﹕2000-3000的比例稀釋，用量為100μl；

2）抗體稀釋液：0.1%BSA1.0g加入PBS至?1000ml，用量為100μl；

3）顯色液：50mg?TMB?，10mL?DMSO，9.8g檸檬酸和1.2ml?30%?H₂O₂?加蒸餾水定容至1000ml，用量為100μl；

4）終止液：雙蒸水178.3mL和98%的濃硫酸21.7mL混合，用量為100μl。

3.?根據權利要求2所述的豬Ⅰ型細環病毒TTSuV1抗體間接ELISA診斷試劑盒，其特征在于：其還包括pH值為7.4，0.2g?KH₂PO₄，2.9g?Na₂HPO₄·12H₂O，8.0g?NaCl，0.2g?KCl，0.5mL?0.05%（V/V）Tween-20，加雙蒸水定容至100ml的洗脫液。

4.?根據權利要求1-3任一項所述的豬Ⅰ型細環病毒TTSuV1抗體間接ELISA診斷試劑盒，其特征在于：用酵母表達的TTSuV1?ORF1a重組蛋包被抗原包被的酶標板中，包被濃度為0.25～1μg/ml。

5.?一種豬Ⅰ型細環病毒TTSuV1抗體間接ELISA診斷試劑盒的制備方法，其特征在于其包括以下步驟：

1）酵母表達的TTSuV1?ORF1a重組蛋白包被抗原的制備

a.?TTSuV1?ORF1a序列獲取：結合?Genebank?數據庫中TTSuV1?序列信息，在病毒基因組序列保守區設計診斷引物SEQ?ID?NO:2和引物SEQ?ID?NO:3；應用rTaq?DNA?聚合酶PCR擴增目的片段，PCR?擴增產物進行電泳，純化、測序獲得已測序列；然后在已測序列基礎上設計反向擴增引物SEQ?ID?NO:4和引物SEQ?ID?NO:5，擴增包括TTSuV1?ORF1全序列的病毒基因序列；應用LA?Taq?DNA聚合酶PCR反向擴增目的片段，對PCR擴增產物進行電泳，純化、獲得TTSuV1?ORF1a蛋白；

b.?TTSuV1?ORF1a的酵母表達：應用Primer?Premier5.0設?計?表?達?引?物SEQ?ID?NO:6和引物SEQ?ID?NO:7，以TTSuV1陽性核酸為模板，應用Kod?plus高保真酶的PCR反應，電泳、純化目的條帶后，雙酶切PCR產物及載體，連接，轉化E.?coli：DH5a，提取重組質粒pPICZa-TTSuV1?ORF1a，Sac?I單酶切線性化；將酵母菌?X-33?制備成感受態細胞，取80mL?感受態細胞與5～10mg線性化的重組表達質粒混合，轉入0.2cm?電轉杯，電轉化，電轉化后的菌液用1?ml冰浴山梨醇10倍稀釋后，涂布于基本葡萄糖培養基選擇平板上，置于30℃培養2～3?d，在200-1000mg/ml濃度Zeocin的YPD平板上篩選具有高Zeocin抗性且生長良好的菌株作為表達株，接種單菌落于25?ml?BMGY培養基，于?30℃培養至OD_600nm?4.0；離心、收集菌體，用?100?ml?BMMY?培養基重懸培養，每日取樣1ml，并補加純甲醇于培養基至終濃度為0.5％，誘導表達6?d，取樣品離心收集上清作?SDS-PAGE?分析，以Anti-HIS-antibody為第一抗體，Western?Blotting篩選出步驟1）TTSuV1?ORF1a蛋白的高拷貝子；

c.?TTSuV1?ORF1a純化：取步驟2）中的篩選出的高考貝子，用?50%硫酸銨沉淀上清中蛋白，溶解，應用親和層析的方法純化酵母表達系統表達的重組?TTSuV1?ORF1a在PBS中透析后，應用BCA法進行定量，獲得酵母表達的TTSuV1?ORF1a重組蛋白，序列為SEQ?ID?NO:1；

2）標準陽性血清和標準陰性血清的篩選

a.?構建插入pET-21空載體?的TTSuV1?ORF1原核表達載體：應用Primer?Premier5.0設計引物SEQ?ID?NO:8和SEQ?ID?NO:9，以TTSuV1陽性核酸為模板，PCR擴增，回收純化PCR目的片段，雙酶切PCR產物及pET-21空載體、連接、轉化E.?coli：DH5a后挑取單克隆菌落，提取質粒，將正確構建的質粒轉化E.?coli：Rosetta(DE3)?pLysS感受態細胞，鑒定出陽性克隆，陽性克隆接種2?ml?LA?液體培養基，37℃，180?rpm?至菌液OD值達到0.6時加入1mM?IPTG，誘導6小時，離心收集菌泥，加入Loading?buffer煮沸樣品，SDS-PAGE?分析蛋白表達，應用?Western?blotting驗證，獲得TTSuV1?ORF1?重組蛋白；

b.?TTSuV1標準陽性血清和標準陰性血清的篩選：制備TTSuV1?ORF1重組蛋白，切膠純化、乳化后以5?mg/頭的劑量免疫２月齡無TTSuV1病原（PCR檢測）的仔豬，１個月后以相同劑量重復免疫，15?天后，采血進行?Western?Blotting和ELISA?實驗，將實驗證明為陽性的血清為TTSuV1?抗體參考陽性血清；利用酵母表達的TTSuV1?ORF1a重組蛋白為固相包被物，對50份血清進行?ELISA?檢測，篩選出與參考陽性血清Western?blotting和ELISA實驗反應信號一致的血清為標準陽性血清；免疫學實驗無信號，且?PCR?檢測TTSuV1病原陰性的血清為標準陰性血清；

3）確定抗原包被濃度和二抗稀釋度

采用棋盤滴定法，先取陽性OD_450nm?值在?1?左右的，然后再從中找出陽性血清?OD_450nm?值和陰性血清?OD_450nm?值之比最高的反應孔的抗原濃度和二抗稀釋度為最佳抗原包被濃度和二抗稀釋度；

4）試劑盒的組裝

按照確定好的包被濃度，用酵母表達的TTSuV1?ORF1a重組蛋白包被酶標板，將酶標板1塊、標準陰陽性血清各1管、抗體稀釋液1瓶、酶標二抗1瓶、底物顯色液1瓶、終止液1瓶、操作說明書一份組裝成ELISA試劑盒。