[發明專利]六聚組氨酸標簽蛋白免疫親和純化富集柱制備及其應用

有效

• 申請號: 201210481545.X
• 申請日: 2012-11-23
• 公開（公告）號: CN103111094A
• 公開（公告）日: 2013-05-22
• 發明（設計）人: 謝體三;謝芝勛;龐耀珊;潘麗金;寧歡歡;張芬;蕭浩
• 申請（專利權）人: 南寧市藍光生物技術有限公司;廣西壯族自治區獸醫研究所
• 主分類號: B01D15/38
• 分類號: B01D15/38;C07K1/22;G01N1/34
• 代理公司: 廣西南寧明智專利商標代理有限責任公司 45106
• 代理人: 黎明天

1.一種六聚組氨酸標簽蛋白免疫親和純化富集柱的制備方法，其特征在于：

1）將免疫親和純化的六聚組氨酸His特異性多克隆抗體采用流式過柱的化學偶聯反應偶聯到過碘酸鈉氧化的瓊脂糖Agarose上，用硼氫化鈉還原，用蒸餾水清洗未結合的抗體，用磷酸緩沖液PBS清洗填料，10倍填料體積/次，洗4次，滴干PBS后加入等體積甘油，混勻，即得His標簽重組蛋白免疫親和填料；

2）將His標簽重組蛋白免疫親和填料裝入塑料柱中，按需要的體積裝柱，即得所述的His標簽重組蛋白免疫親和純化富集柱。

2.根據權利要求1所述的六聚組氨酸標簽蛋白免疫親和純化富集柱的制備方法，其特征在于：所制的His標簽重組蛋白免疫親和純化富集柱，包含偶聯有免疫親和純化的His特異性多克隆抗體的瓊脂糖填料及裝載該免疫親和填料的塑料柱。

3.根據權利要求1所述的六聚組氨酸標簽蛋白免疫親和純化富集柱的制備方法，其特征在于：所述的免疫親和純化的His特異性多克隆抗體，是用His短肽偶聯活化的載體蛋白制得免疫原免疫動物，得到含抗體血清，將含抗體血清上到偶聯有His短肽的免疫親和層析柱，清洗未結合的雜質，用弱酸洗脫下His特異性多克隆抗體，脫鹽、凍干備用。

4.根據權利要求3所述的六聚組氨酸標簽蛋白免疫親和純化富集柱的制備方法，其特征在于：所述的His短肽，采用His六聚組氨酸中的4組氨基酸殘基，分成2組以相反方向引入半胱氨酸巰基SH基團制得巰基化的His短肽，其序列為:1）半胱氨酰-組氨酰-組氨酰-組氨酰-組氨酸即C-HHHH，2）組氨酰-組氨酰-組氨酰-組氨酰-半胱氨酸即HHHH-C。

5.根據權利要求3所述的六聚組氨酸標簽蛋白免疫親和純化富集柱的制備方法，其特征在于：所述的His短肽偶聯活化的載體蛋白制得的免疫原，用十二烷基磺酸鈉SDS變性血藍蛋白KLH或卵清蛋白OVA等常用載體蛋白，再與碘乙酰-羥基琥珀酰亞胺酯即碘乙酰-NHS反應生成碘乙酰化?KLH或OVA?。

6.通過葡聚糖凝膠G25?Sephadex脫鹽去掉過量的碘乙酸后，將巰基化His短肽與碘乙酰化的KLH或OVA混合，調pH=8.5，在室溫搖動反應60分鐘，經G25?Sephadex脫鹽后得到的為免疫原。

7.根據權利要求3所述的六聚組氨酸標簽蛋白免疫親和純化富集柱的制備方法，其特征在于：所述偶聯有His短肽的免疫親和層析柱，是將2種方向相反巰基化的His短肽半抗原與碘乙酰化的Agarose反應，形成化學共價鍵復合體填料His-Agarose，將His-Agarose裝柱即得偶聯有His短肽的免疫親和層析柱。

8.一種六聚組氨酸標簽蛋白免疫親和純化富集柱的應用，是將免疫親和純化富集柱與用辣根過氧化物酶標記HRP的免疫親和純化的His特異性多克隆抗體聯用。