[發(fā)明專利]六聚組氨酸標(biāo)簽蛋白免疫親和純化富集柱制備及其應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210481545.X
• 申請日: 2012-11-23
• 公開（公告）號: CN103111094A
• 公開（公告）日: 2013-05-22
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 謝體三;謝芝勛;龐耀珊;潘麗金;寧歡歡;張芬;蕭浩
• 申請（專利權(quán)）人: 南寧市藍光生物技術(shù)有限公司;廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所
• 主分類號: B01D15/38
• 分類號: B01D15/38;C07K1/22;G01N1/34
• 代理公司: 廣西南寧明智專利商標(biāo)代理有限責(zé)任公司 45106
• 代理人: 黎明天

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種生物分離、純化富集裝置，尤其是一種高效分離純化、富集六聚組氨酸His標(biāo)簽重組蛋白的免疫親和純化富集柱的制備方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

分子生物學(xué)及蛋白質(zhì)組學(xué)是生命科學(xué)研究領(lǐng)域的熱門學(xué)科，重組蛋白質(zhì)的使用在近年來大大增加。為方便基因重組蛋白的標(biāo)記、追蹤、鑒定和純化，在目標(biāo)蛋白表達中會人為引進一段標(biāo)簽多肽形成重組蛋白。因此分離純化、富集重組蛋白的技術(shù)越來越顯示其重要性。從成份復(fù)雜的表達體系中分離純化、富集目標(biāo)蛋白是一項艱巨而繁重的任務(wù)，而親和層析法是目前最廣泛的分離純化、富集重組蛋白的方法。

由于目前用于分離純化、富集His重組蛋白的親和層析柱主要有金屬螯合親和柱以及利用酶的底物、反應(yīng)性燃料為配基的親和柱，這些親和柱存在非特異性吸附、洗脫條件劇烈、提純效果不佳等顯著缺點，而且金屬螯合親和柱還存在金屬離子脫落到洗脫液中的缺陷，這些都將限制分離提純出來的目標(biāo)蛋白后續(xù)的應(yīng)用、檢測。His標(biāo)簽多肽分子量小，不影響目標(biāo)蛋白的功能，并具有容易分離和純化的特點，是目前用于純化的標(biāo)簽重組蛋白中使用最為廣泛的一種。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種高效、特異性分離純化、富集His標(biāo)簽重組蛋白的免疫親和純化富集柱制備方法及其應(yīng)用。

為達上述目的，本發(fā)明2次采用抗原抗體的特異性反應(yīng)和可離解的特性Ag?+?Ab?(固相)?????????????????????????????????????????????????Ag-Ab?（固相）原理，具體如下：

首先利用這一原理將His短肽半抗原偶聯(lián)于Agarose上制得His-?Agarose親和柱，用于提取His特異性多克隆抗體。

再利用這一原理將提取所得的抗His特異性抗體Anti-His偶聯(lián)到Agarose上制得Anti-His-?Agarose免疫親和柱，用于分離純化、富集細胞裂解液中的His標(biāo)簽重組蛋白。

根據(jù)上述機理，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

一種六聚組氨酸標(biāo)簽蛋白免疫親和純化富集柱的制備方法，其特征在于：

1）將免疫親和純化的六聚組氨酸His特異性多克隆抗體采用流式過柱的化學(xué)偶聯(lián)反應(yīng)偶聯(lián)到過碘酸鈉氧化的瓊脂糖Agarose上，用硼氫化鈉還原，用蒸餾水清洗未結(jié)合的抗體，用磷酸緩沖液PBS清洗填料，10倍填料體積/次，洗4次，滴干PBS后加入等體積甘油，混勻，即得His標(biāo)簽重組蛋白免疫親和填料；

2）將His標(biāo)簽重組蛋白免疫親和填料裝入塑料柱中，按需要的體積裝柱，即得所述的His標(biāo)簽重組蛋白免疫親和純化富集柱。

所制的His標(biāo)簽重組蛋白免疫親和純化富集柱，包含偶聯(lián)有免疫親和純化的His特異性多克隆抗體的瓊脂糖填料及裝載該免疫親和填料的塑料柱。

所述的免疫親和純化的His特異性多克隆抗體，是用His短肽偶聯(lián)活化的載體蛋白制得免疫原免疫動物，得到含抗體血清，將含抗體血清上到偶聯(lián)有His短肽的免疫親和層析柱，清洗未結(jié)合的雜質(zhì)，用弱酸洗脫下His特異性多克隆抗體，脫鹽、凍干備用。

所述的His短肽，采用His六聚組氨酸中的4組氨基酸殘基，分成2組以相反方向引入半胱氨酸巰基SH基團制得巰基化的His短肽，其序列為:1）半胱氨酰-組氨酰-組氨酰-組氨酰-組氨酸即C-HHHH，2）組氨酰-組氨酰-組氨酰-組氨酰-半胱氨酸即HHHH-C。

所述的His短肽偶聯(lián)活化的載體蛋白制得的免疫原，用十二烷基磺酸鈉SDS變性血藍蛋白KLH或卵清蛋白OVA等常用載體蛋白，再與碘乙酰-羥基琥珀酰亞胺酯即碘乙酰-NHS反應(yīng)生成碘乙酰化?KLH或OVA?。通過葡聚糖凝膠G25?Sephadex脫鹽去掉過量的碘乙酸后，將巰基化His短肽與碘乙酰化的KLH或OVA混合，調(diào)pH=8.5，在室溫搖動反應(yīng)60分鐘，經(jīng)G25?Sephadex脫鹽后得到的為免疫原。

所述偶聯(lián)有His短肽的免疫親和層析柱，是將2種方向相反巰基化的His短肽半抗原與碘乙酰化的Agarose反應(yīng)，形成化學(xué)共價鍵復(fù)合體填料His-Agarose，將His-Agarose裝柱即得偶聯(lián)有His短肽的免疫親和層析柱。

一種六聚組氨酸標(biāo)簽蛋白免疫親和純化富集柱的應(yīng)用，是將免疫親和純化富集柱與用辣根過氧化物酶標(biāo)記HRP的免疫親和純化的His特異性多克隆抗體聯(lián)用。

本發(fā)明的優(yōu)點：

本發(fā)明所制得的免疫親和純化富集柱，具有以下顯著優(yōu)勢：