[發明專利]旗肽標簽重組蛋白免疫親和純化富集柱制備及其應用

有效

• 申請號: 201210481370.2
• 申請日: 2012-11-23
• 公開（公告）號: CN103111093A
• 公開（公告）日: 2013-05-22
• 發明（設計）人: 寧歡歡;張芬;潘麗金;謝體三;蕭浩
• 申請（專利權）人: 南寧市藍光生物技術有限公司
• 主分類號: B01D15/38
• 分類號: B01D15/38;C07K1/22
• 代理公司: 廣西南寧明智專利商標代理有限責任公司 45106
• 代理人: 黎明天

技術領域

本發明涉及一種生物分離、純化富集裝置，尤其是一種高效分離純化、富集旗肽D-tag標簽重組蛋白的免疫親和純化富集柱的制備方法及其應用。

背景技術

分子生物學及蛋白質組學是生命科學研究領域的熱門學科，重組蛋白質的使用在近年來大大增加。為方便基因重組蛋白的標記、追蹤、鑒定和純化，在目標蛋白表達中會人為引進一段標簽多肽形成重組蛋白。因此分離純化、富集重組蛋白的技術越來越顯示其重要性。從成份復雜的表達體系中分離純化、富集目標蛋白是一項艱巨而繁重的任務，而親和層析法是目前最廣泛的分離純化、富集重組蛋白的方法。

由于目前用于分離純化、富集D-tag重組蛋白的親和層析柱主要有金屬螯合親和柱以及利用酶的底物、反應性燃料為配基的親和柱，這些親和柱存在非特異性吸附、洗脫條件劇烈、提純效果不佳等顯著缺點，而且金屬螯合親和柱還存在金屬離子脫落到洗脫液中的缺陷，這些都將限制分離提純出來的目標蛋白后續的應用、檢測。D-tag作為融合表達標簽，其通常不會與目的蛋白相互作用并且通常不會影響目的蛋白的功能、性質，這樣就有利用研究人員對融合蛋白進行下游研究。因此現D-tag標簽已廣泛的應用于蛋白表達、純化、鑒定、功能研究及其蛋白相互作用等相關領域。

發明內容

本發明的目的是提供一種高效、特異性分離純化、富集D-tag標簽重組蛋白的免疫親和純化富集柱制備方法及其應用。

為達上述目的，本發明2次采用抗原抗體的特異性反應和可離解的特性Ag?+?Ab?(固相)?????????????????????????????????????????????????Ag-Ab?（固相）原理，具體如下：

首先利用這一原理將D-tag短肽半抗原偶聯于Agarose上制得D-tag-?Agarose親和柱，用于提取D-tag特異性多克隆抗體。

再利用這一原理將提取所得的抗D-tag特異性抗體Anti-D-tag偶聯到Agarose上制得Anti-D-tag-?Agarose免疫親和柱，用于分離純化、富集細胞裂解液中的D-tag標簽重組蛋白。

根據上述機理，本發明采用如下技術方案：

一種旗肽標簽重組蛋白免疫親和純化富集柱的制備，其特征在于：

1）將免疫親和純化的D-tag特異性多克隆抗體采用流式過柱的化學偶聯反應偶聯到過碘酸鈉氧化的瓊脂糖Agarose上，用硼氫化鈉還原，用蒸餾水清洗未結合的抗體，用磷酸緩沖液PBS清洗填料，10倍填料體積/次，洗4次，滴干PBS后加入等體積甘油，混勻，得到D-tag標簽重組蛋白免疫親和填料；

2）將D-tag標簽重組蛋白免疫親和填料裝入塑料柱中，按需要的體積裝柱，即得所述的D-tag標簽重組蛋白免疫親和純化富集柱。

所述方法制備的D-tag標簽重組蛋白免疫親和純化富集柱，包含偶聯有免疫親和純化的D-tag特異性多克隆抗體的瓊脂糖填料及裝載該免疫親和填料的塑料柱。

所述免疫親和純化的D-tag特異性多克隆抗體，是用D-tag短肽偶聯活化的載體蛋白制得免疫原免疫動物，得到含抗體血清，將含抗體血清上到偶聯有D-tag短肽的免疫親和層析柱，清洗未結合的雜質，用弱酸洗脫下D-tag特異性多克隆抗體，脫鹽、凍干備用。

所述的?D-tag肽是由8個氨基酸即天冬氨酰-酪氨酰-賴氨酰-天冬氨酰-天冬氨酰-天冬氨酰-天冬氨酰-賴氨酸組成的短肽，采用這8個氨基酸殘基分成2組以相反方向引入半胱氨酸巰基SH基團制得巰基化的D-tag短肽，其序列為：1）半胱氨酰-天冬氨酰-天冬氨酰-天冬氨酰-賴氨酸即C-DDDK,2)?天冬氨酰-酪氨酰-賴氨酰-天冬氨酰-半胱氨酸即DYKD-C。見序列表。

所述的D-tag短肽偶聯活化的載體蛋白制得的免疫原，用十二烷基磺酸鈉SDS變性血藍蛋白KLH或卵清蛋白OVA等常用載體蛋白，再與碘乙酰-羥基琥珀酰亞胺酯即碘乙酰-NHS反應生成碘乙酰化?KLH或OVA?；通過葡聚糖凝膠G25?Sephadex脫鹽去掉過量的碘乙酸后，將巰基化D-tag短肽與碘乙酰化的KLH或OVA混合，調pH=8.5，在室溫搖動反應60分鐘，經G25?Sephadex脫鹽后得到的為免疫原。

所述偶聯有D-tag短肽的免疫親和層析柱，是將2種方向相反巰基化的D-tag短肽半抗原與碘乙酰化的Agarose反應，形成化學共價鍵復合體填料D-tag-Agarose,將D-tag-Agarose裝柱即得偶聯有D-tag短肽的免疫親和層析柱。