[發明專利]旗肽標簽重組蛋白免疫親和純化富集柱制備及其應用

有效

• 申請號: 201210481370.2
• 申請日: 2012-11-23
• 公開（公告）號: CN103111093A
• 公開（公告）日: 2013-05-22
• 發明（設計）人: 寧歡歡;張芬;潘麗金;謝體三;蕭浩
• 申請（專利權）人: 南寧市藍光生物技術有限公司
• 主分類號: B01D15/38
• 分類號: B01D15/38;C07K1/22
• 代理公司: 廣西南寧明智專利商標代理有限責任公司 45106
• 代理人: 黎明天

1.一種旗肽標簽重組蛋白免疫親和純化富集柱的制備，其特征在于：

1）將免疫親和純化的旗肽D-tag特異性多克隆抗體采用流式過柱的化學偶聯反應偶聯到過碘酸鈉氧化的瓊脂糖Agarose上，用硼氫化鈉還原，用蒸餾水清洗未結合的抗體，用磷酸緩沖液PBS清洗填料，10倍填料體積/次，洗4次，滴干PBS后加入等體積甘油，混勻，得到D-tag標簽重組蛋白免疫親和填料；

2）將D-tag標簽重組蛋白免疫親和填料裝入塑料柱中，按需要的體積裝柱，即得所述的D-tag標簽重組蛋白免疫親和純化富集柱。

2.?根據權利要求1所述的旗肽標簽重組蛋白免疫親和純化富集柱的制備，其特征在于：所述方法制備的D-tag標簽重組蛋白免疫親和純化富集柱，包含偶聯有免疫親和純化的D-tag特異性多克隆抗體的瓊脂糖填料及裝載該免疫親和填料的塑料柱。

3.根據權利要求1所述的旗肽標簽重組蛋白免疫親和純化富集柱的制備，其特征在于：所述的免疫親和純化的D-tag特異性多克隆抗體，是用D-tag短肽偶聯活化的載體蛋白制得免疫原免疫動物，得到含抗體血清，將含抗體血清上到偶聯有D-tag短肽的免疫親和層析柱，清洗未結合的雜質，用弱酸洗脫下D-tag特異性多克隆抗體，脫鹽、凍干備用。

4.根據權利要求3所述的旗肽標簽重組蛋白免疫親和純化富集柱的制備，其特征在于：所述的?D-tag肽是由8個氨基酸即天冬氨酰-酪氨酰-賴氨酰-天冬氨酰-天冬氨酰-天冬氨酰-天冬氨酰-賴氨酸組成的短肽，采用這8個氨基酸殘基分成2組以相反方向引入半胱氨酸巰基SH基團制得巰基化的D-tag短肽，其序列為：1）半胱氨酰-天冬氨酰-天冬氨酰-天冬氨酰-賴氨酸即C-DDDK,2)?天冬氨酰-酪氨酰-賴氨酰-天冬氨酰-半胱氨酸即DYKD-C。

5.?根據權利要求3所述的旗肽標簽重組蛋白免疫親和純化富集柱的制備，其特征在于：所述的D-tag短肽偶聯活化的載體蛋白制得的免疫原，用十二烷基磺酸鈉SDS變性血藍蛋白KLH或卵清蛋白OVA等常用載體蛋白，再與碘乙酰-羥基琥珀酰亞胺酯即碘乙酰-NHS反應生成碘乙酰化?KLH或OVA?；通過葡聚糖凝膠G25?Sephadex脫鹽去掉過量的碘乙酸后，將巰基化D-tag短肽與碘乙酰化的KLH或OVA混合，調pH=8.5，在室溫搖動反應60分鐘，經G25?Sephadex脫鹽后得到的為免疫原。

6.根據權利要求3所述的旗肽標簽重組蛋白免疫親和純化富集柱的制備，其特征在于：所述偶聯有D-tag短肽的免疫親和層析柱，是將2種方向相反巰基化的D-tag短肽半抗原與碘乙酰化的Agarose反應，形成化學共價鍵復合體填料D-tag-Agarose,將D-tag-Agarose裝柱即得偶聯有D-tag短肽的免疫親和層析柱。

7.一種旗肽標簽重組蛋白免疫親和純化富集柱的應用，其特征在于：所述免疫親和純化富集柱與用辣根過氧化物酶HRP標記免疫親和純化的D-tag特異性多克隆抗體聯用。