[發明專利]一株重組大腸桿菌及用其制備溶血性磷脂酶C的方法

有效

• 申請號: 201210480632.3
• 申請日: 2012-11-23
• 公開（公告）號: CN102978146A
• 公開（公告）日: 2013-03-20
• 發明（設計）人: 張梁;石貴陽;趙金星;丁重陽;顧正華
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/55;C12N15/70;C12N9/16;C12R1/19
• 代理公司: 無錫華源專利事務所 32228
• 代理人: 馮智文

技術領域

本發明屬于基因工程和微生物發酵技術領域，具體涉及一株重組大腸桿菌及用其制備溶血性磷脂酶C的方法。

背景技術

磷脂酶C（PLC），又可稱為可定向分解磷脂生成甘油二酯和磷酸單酯，細菌來源的磷脂酶C根據底物特異性的不同主要分為磷脂酰特異性磷脂酶C（PC-PLC）和磷脂酰肌醇特異性磷脂酶C（PI-PLC）。PLC水解產物甘油二酯是一種生理活性物質，在細胞信號傳導途徑上起著第二信使的作用，能激活蛋白激酶C（PKC）而引起細胞增殖、分化、收縮、分泌和代謝等功能變化，此外還具有明顯的抗血小板粘附、聚集等功能，因此又被稱作溶血性磷脂酶C。溶血性PLC對新型抗血小板藥物、心腦血管疾病類藥物的開發具有一定的潛在價值，對抗靜脈血栓及高血壓醫療方面的研究意義重大。隨著對PLC研究的不斷深入及工業發展的需求，PLC的應用價值已經逐漸從藥品生產擴展至油脂精煉、磷脂改性、食品加工等領域。例如：在油脂精煉中，利用PLA和PLC混合物進行酶法脫膠，可完全除去磷脂，比水、酸或苛性堿脫膠具有更高的油產率；食品工業中PLC可用來改善在面包在烤制時其表面產生的老化現象，緩和梨皮狀表皮。

近年來，隨著PLC在食品、醫藥、飼料等領域的廣泛應用，國內外學者對其進行了大量的研究。國外對PLC的研究一直處于領先水平，例如：1982年Vasil等人構建了一株P.aeruginosaPAO2003(pVB81)-CT，其所產溶血性PLC的酶活達到了442.8U/ml（Vasil?ML，Berka?MR，Gray?GL，Nakai?H.Cloning?of?aphosphate-regulated?hemolysin?gene(phospholipase?C)from?Pseudomonasaeruginosa.Journal?of?Bacteriology，1982，152：431-440.）；1990年Ostroff等人將構建的重組質粒pGEM2/PLC-H導入到E.coli?BL21（DE3）中，成功得到了一株產溶血性PLC的菌株，該菌株的PLC活性可達到166.7U/ml（Ostroff?RM，VasilAI，Vasil?ML.Molecular?comparison?of?a?nonhemolytic?and?a?hemolyticphospholipase?C?from?Pseudomonas?aeruginosa.Journal?of?Bacteriology，1990，172(10)：5915-5923.)；1997年Cota-Gomez等人成功構建了E.coli?BL21（DE3）pGEM-plcHR，該菌株可產溶血性PLC，其酶活達到24.1U/毫克（Cota-Gomez?A，Vasil?AI，Kadurugamuwa?J，Beveridge?TJ，Schweizer?HP，Vasil?ML.PlcR1?and?PlcR2are?putative?calcium-binding?proteins?required?for?secretion?of?the?hemolyticphospholipase?C?of?Pseudomonas?aeruginosa.Infection?and?Immunity，1997，65：2904-2913.）。國內對磷脂酶C的研究雖起步較晚，但也取得了一定成果，例如：2005年陳濤等人對篩選到的產PLC菌株Bacillus?cereus?Shenzhen754-1進行三次紫外線和兩次Co60-γ射線誘變處理，篩選出三株高PLC活性的誘變株，酶活分別達到14.878、16.450、16.400U/ml（陳濤，王常高，劉曉輝，何東平.高產磷脂酶C菌株的誘變選育.天然產物研究與開發，2005，17(6)：712-716.）；2007年高林對Bacillus?cereus?Shenzhen?754-1進行培養條件的優化，將酶活提高至26U/mL（高林.磷脂酶C高產菌株的篩選、鑒定和培養條件的優化研究.安徽農業大學的碩士學位論文，2007.）；2010年詹逸舒篩選到一株Bacillus?cereus?Z-13，用卵黃瓊脂杯碟法測定該菌株所產生的PLC的沉淀圈（乳白色沉淀圈），其直徑可達30mm，酶活達到23.31U/ml（詹逸舒.產磷脂酶C菌株的篩選及其酶學性質的研究.湖南農業大學的碩士學位論文，2010.）。