[發明專利]一株重組大腸桿菌及用其制備溶血性磷脂酶C的方法

有效

• 申請號: 201210480632.3
• 申請日: 2012-11-23
• 公開（公告）號: CN102978146A
• 公開（公告）日: 2013-03-20
• 發明（設計）人: 張梁;石貴陽;趙金星;丁重陽;顧正華
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/55;C12N15/70;C12N9/16;C12R1/19
• 代理公司: 無錫華源專利事務所 32228
• 代理人: 馮智文

1.一株重組大腸桿菌（Escherichia?coli）BL21（DE3）/pET-plcH，保藏編號為CCTCC?No.M?2012425。

2.根據權利要求1所述重組大腸桿菌BL21（DE3）/pET-plcH，CCTCC?No.M2012425，其特征在于由下述方法制得：

（1）以保藏編號為CGMCC?No.1.205的銅綠假單胞菌（P.aeruginosa）的基因組為模板，克隆得到溶血性磷脂酶C基因，其堿基序列如SEQ?ID?NO：1所示；

（2）將步驟（1）所得溶血性磷脂酶C基因克隆到表達載體pET-28a（+）上，得到重組載體；

（3）將步驟（2）所得重組載體轉化大腸桿菌感受態細胞，構建得到重組大腸桿菌。

3.用權利要求1～2任一項所述重組大腸桿菌BL21（DE3）/pET-plcH，CCTCCNo.M?2012425制備溶血性磷脂酶C的方法，其特征在于以該重組大腸桿菌為發酵菌株進行液體發酵，制備溶血性磷脂酶C。

4.根據權利要求3所述制備溶血性磷脂酶C的方法，其特征在于具體步驟如下：

（1）種子培養：將所述重組大腸桿菌BL21（DE3）/pET-plcH，CCTCC?No.M2012425接種于種子培養基中，于30～37℃振蕩培養8～12h，搖床轉速150～200r/min；

（2）液體發酵培養：將經過步驟（1）培養所得活化種子液按體積百分比3～10％的接種量接種至發酵培養基，于30～37℃振蕩培養4～6h小時，搖床轉速150～200r/min；再添加乳糖，于20～30℃振蕩誘導培養14～22h，搖床轉速150～200r/min；最后添加甘氨酸，于相同條件下繼續振蕩誘導培養18～36h，發酵完畢，得到發酵液；

（3）粗酶液的提取：將步驟（2）所得發酵液離心；收集上清液，即為胞外粗酶液；收集菌體細胞沉淀并超聲破碎，將所得超聲破碎液離心，取上清，即為胞內粗酶液。

5.根據權利要求4所述制備溶血性磷脂酶C的方法，其特征在于步驟（1）所述種子培養基成分按克/升計為：蛋白胨9～11g，酵母粉4～6g，NaCl?9～11g，其余成分為水。

6.根據權利要求4所述制備溶血性磷脂酶C的方法，其特征在于步驟（2）所述發酵培養基成分按克/升計為：蛋白胨9～11g，酵母粉5～24g，甘油0～5g，其余成分為0.25mol/L?Tris-HCl（pH7.2）。

7.根據權利要求4所述制備溶血性磷脂酶C的方法，其特征在于步驟（2）所述乳糖的添加量為每升所述發酵培養基0.1～5g。

8.根據權利要求4所述制備溶血性磷脂酶C的方法，其特征在于步驟（2）所述甘氨酸的添加量為每升所述發酵培養基0～3g。