[發(fā)明專利]大腸桿菌O157的環(huán)介導等溫擴增檢測引物組、檢測方法和試劑盒

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210480291.X
• 申請日: 2012-11-22
• 公開（公告）號: CN102943113A
• 公開（公告）日: 2013-02-27
• 發(fā)明（設計）人: 張淑紅;吳清平;張菊梅;賴則冰;李海剛
• 申請（專利權）人: 廣東省微生物研究所;廣東環(huán)凱微生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/10;C12N15/11
• 代理公司: 廣州科粵專利商標代理有限公司 44001
• 代理人: 劉明星

技術領域：

本發(fā)明屬于生物技術領域，具體涉及一種大腸桿菌O157的環(huán)介導等溫擴增檢測引物組、檢測方法和試劑盒。?

背景技術：

大腸埃希氏菌O157（Escherichia?coli?O157）是一類能引起嚴重食物中毒的致瀉大腸桿菌,Escherichia?coli?O157：H7是出血性大腸桿菌的主要血清型。自1982年以來，E.coli?O157∶H7相繼在美國、英國、加拿大、日本等國家引起暴發(fā)和流行。該致病菌是引起腹瀉和出血性腸炎的重要致病菌，有2%~7%的病人會出現(xiàn)出血性腎病綜合征，其感染已經(jīng)成為世界性問題。除E.coli?O157∶H7以外，產(chǎn)志賀毒素可發(fā)酵山梨醇的大腸埃希氏菌O157：NM(nonmobile)已經(jīng)成為歐洲大陸過去10年重要的致病菌。人感染E.coli?O157∶H7的主要途徑是食用或接觸被污染的牛肉、牛奶、蔬菜、水果和水源等，而且引發(fā)感染的劑量極低，僅攝取10個活菌就有可能致病，可引起出血性腹瀉、出血性結腸炎、出血性尿毒癥，甚至死亡。?

對于E.coli?O157的檢測，我國現(xiàn)行國標GB/T?4789.36-2008中采用的方法是采用改良EC肉湯培養(yǎng)基（mEC+n），在36℃培養(yǎng)18~24h進行前增菌，然后平板劃線顯色培養(yǎng)基，或者免疫磁珠富集后平板劃線顯色培養(yǎng)基，之后挑取可疑菌落進行形態(tài)、染色及血清學試驗、生化鑒定等進行最終判定，檢測過程耗時長達2-4d，難以適應大批量食品樣品快速檢驗的要求。我國行業(yè)進出口食品標準SN/T?0973-2010對E.coli?O157:H7目前采用的方法是對樣品在改良EC肉湯培養(yǎng)基（mEC+n）增菌后進行免疫學方法檢測，同時輔助其他生化鑒定方法，此方法同國標方法有類似之處，檢測周期比較長。?

近年來，大腸桿菌O157分子檢測方法如PCR、LAMP方法等逐漸建立起來，這些方法具有較高的特異性和靈敏性，但是由于食品種類復雜，樣品成品及其背景微生物對E.coliO157的干擾較多，加上E.coli?O157受到培養(yǎng)溫度、鹽度、pH值及培養(yǎng)基各種組分等因素的影響較大，因此，目前的各種方法中，還沒有一套完善、高效、靈敏的檢測方法適用于所有來源的樣品包括（食品、水、土壤及臨床樣本）。此外，最近的研究發(fā)現(xiàn)，改良EC肉湯由于膽鹽和新生霉素等抑菌劑含量較高，對目標菌E.coli?O157的復蘇和生長有一定影響，導致在一些復雜基質(zhì)的樣品中E.coli?O157無法檢出。?

發(fā)明內(nèi)容：

本發(fā)明的第一目的是提供一種應用環(huán)介導等溫擴增檢測大腸埃希氏菌（Escherichia?coli）O157的檢測引物組，利用該檢測引物組可以特異性的檢測大腸埃希氏菌O157。?

本發(fā)明的應用環(huán)介導等溫擴增檢測大腸埃希氏菌（Escherichia?coli）O157的檢測引物組，其特征在于，由下列引物組成：?

上游外引物F3：5’-TGCAACTACTGTAAGTAATGGA-3’；?

下游外引物B3：5’-TTGTTCTATGTCACTAACAGAC-3’；?

上游內(nèi)引物FIP：5’-TGTTGGAACAATAACTTCATCTCCT-ACGGTTGCTCTTCATTTAGC-3’；?

下游內(nèi)引物BIP：5’-AATGCTATAAAATACACAGGAGCCA-ATTTGCCAAGTTTCATTATCTGA-3’。?

本發(fā)明的第二個目的是提供一種非疾病的診斷和治療目的的大腸埃希氏菌O157的檢測方法，其特征在于，對樣品進行增菌培養(yǎng)獲得增菌液，提取增菌液中的細菌DNA，然后通過?環(huán)介導等溫擴增的方法用上述檢測引物組對細菌DNA進行選擇性擴增，確認是否存在有擴增產(chǎn)物。?

所述的樣品優(yōu)選為肉制品，如豬肉和牛肉。?

所述的對樣品進行增菌培養(yǎng)優(yōu)選是將樣品接入選擇性增菌液中，然后在42±1℃培養(yǎng)6~8小時，獲得增菌液，所述的選擇性增菌液為每225ml緩沖蛋白胨水中含有8mg萬古霉素。利用該選擇性增菌液可以選擇的對肉制品中的大腸埃希氏菌O157進行增菌，BPW-V進行增菌，有利于E.coli?O157的復蘇和生長，且萬古霉素抗生素的低劑量使用，可以有效抑制其他競爭菌的生長，42℃溫度增菌培養(yǎng)也可以有效降低肉制品中其他雜菌的生長，提高目標菌E.coliO157的檢出率，更有利于對肉制品進行檢測。?