[發明專利]大腸桿菌O157的環介導等溫擴增檢測引物組、檢測方法和試劑盒

有效

• 申請號: 201210480291.X
• 申請日: 2012-11-22
• 公開（公告）號: CN102943113A
• 公開（公告）日: 2013-02-27
• 發明（設計）人: 張淑紅;吳清平;張菊梅;賴則冰;李海剛
• 申請（專利權）人: 廣東省微生物研究所;廣東環凱微生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/10;C12N15/11
• 代理公司: 廣州科粵專利商標代理有限公司 44001
• 代理人: 劉明星

1.一種應用環介導等溫擴增檢測大腸埃希氏菌（Escherichia?coli）O157的檢測引物組，其特征在于，由下列引物組成：

上游外引物F3：5’-TGCAACTACTGTAAGTAATGGA-3’；

下游外引物B3：5’-TTGTTCTATGTCACTAACAGAC-3’；

上游內引物FIP：5’-TGTTGGAACAATAACTTCATCTCCT-ACGGTTGCTCTTCATTTAGC-3’；

下游內引物BIP：5’-AATGCTATAAAATACACAGGAGCCA-ATTTGCCAAGTTTCATTATCTGA-3’。

2.一種非疾病的診斷和治療目的的大腸埃希氏菌O157的檢測方法，其特征在于，對樣品進行增菌培養獲得增菌液，提取增菌液中的細菌DNA，然后通過環介導等溫擴增的方法用權利要求1所述的檢測引物組對細菌DNA進行選擇性擴增，確認是否存在有擴增產物。

3.根據權利要求2所述的檢測方法，其特征在于，所述的樣品為肉制品。

4.根據權利要求3所述的檢測方法，其特征在于，所述的肉制品為豬肉或牛肉。

5.根據權利要求3或4所述的檢測方法，其特征在于，所述的對樣品進行增菌培養是將樣品接入選擇性增菌液中，然后在42±1℃培養6~8小時，獲得增菌液，所述的選擇性增菌液為每225ml緩沖蛋白胨水中含有8mg萬古霉素。

6.根據權利要求2所述的檢測方法，其特征在于，所述的通過環介導等溫擴增的方法用權利要求1所述的檢測引物組對細菌DNA進行選擇性擴增具體為：環介導等溫擴增體系為體系總體積25μL，包括2.5μL?10×Thermopol反應緩沖液、0.4μL?10mmol/LdNTPs、0.5μL10μmol/L上游外引物F3、0.5μL?10μmol/L下游外引物B3、1μL?40μmol/L上游內引物FIP、1μL?40μmol/L下游內引物BIP、0.6μL100mmol/L?MgSO₄、12.5μL?2mol/L甜菜堿、4μL滅菌雙蒸水ddH₂O，Bst?DNA聚合酶8U/μL和2μL細菌DNA，反應條件為在溫度為65℃孵育45~60min。

7.根據權利要求2所述的檢測方法，其特征在于，所述的確認是否存在有擴增產物是利用電泳檢測、熒光顯色檢測或濁度檢測環介導等溫擴增反應產物是否具有擴增產物。

8.根據權利要求7所述的檢測方法，其特征在于，所述的用熒光顯色檢測，具體是在反應管中加入SYBR?Green?Ⅰ顯色劑，1~5min后觀察結果，如果顏色為橙色，則樣品大腸埃希氏菌O157陰性，無大腸埃希氏菌O157，如果顏色為綠色，則樣品大腸埃希氏菌O157陽性，含有大腸埃希氏菌O157。

9.一種大腸埃希氏菌O157的檢測試劑盒，包括環介導等溫擴增試劑和檢測引物組，其特征在于，所述的檢測引物組由下列引物組成：

上游外引物F3：5’-TGCAACTACTGTAAGTAATGGA-3’

下游外引物B3：5’-TTGTTCTATGTCACTAACAGAC-3’

上游內引物FIP：5’-TGTTGGAACAATAACTTCATCTCCT-ACGGTTGCTCTTCATTTAGC-3’

下游內引物BIP：5’-AATGCTATAAAATACACAGGAGCCA-ATTTGCCAAGTTTCATTATCTGA-3’。

10.根據權利要求9所述的檢測試劑盒，其特征在于，所述的大腸埃希氏菌O157的檢測試劑盒還包括選擇性增菌液，該選擇性增菌液為每225ml緩沖蛋白胨水中含有8mg萬古霉素。