[發(fā)明專利]一種內(nèi)切葡聚糖酶編碼基因和重組酶及應(yīng)用

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210480158.4
• 申請(qǐng)日: 2012-11-22
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN102936601A
• 公開(kāi)（公告）日: 2013-02-20
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 侯進(jìn)慧;劉彤;陳宏偉;王富威
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 徐州工程學(xué)院
• 主分類(lèi)號(hào): C12N15/56
• 分類(lèi)號(hào): C12N15/56;C12N9/42;C12N15/70;C12N1/21;C12P19/14;C12R1/19
• 代理公司: 徐州市三聯(lián)專利事務(wù)所 32220
• 代理人: 周愛(ài)芳

1.一種重組內(nèi)切葡聚糖酶編碼基因，其特征在于：所述酶基因序列為SEQ?IDNO.1。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種內(nèi)切葡聚糖酶編碼基因，其特征在于：所述重組內(nèi)切葡聚糖酶基因編碼的氨基酸序列為SEQ?ID?NO.2。

3.一種權(quán)利要求1或2所述的一種重組內(nèi)切葡聚糖酶的制備方法，其特征在于：

（1）重組內(nèi)切葡聚糖酶菌株EG/BL21(DE3)的構(gòu)建：

使用引物F:CATATGAGAGTTAAGCCAGTGT，R:CTCGAGACGCTTTTCCTGATAA；以PCR方法從菌株P(guān)antoea?ananatis?P5（CGMCC?NO.5356）基因組中克隆獲得內(nèi)切葡聚糖酶編碼基因全長(zhǎng)，將該基因通過(guò)限制性內(nèi)酶NdeI和XhoI酶切后，連接到原核表達(dá)載體pET258中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pETEG，轉(zhuǎn)化大腸埃希氏菌E.coli?BL21(DE3)細(xì)胞，篩選獲得高效表達(dá)重組內(nèi)切葡聚糖酶的菌株，即重組大腸埃希氏菌EG/BL21(DE3)；

（2）重組菌株EG/BL21(DE3)的發(fā)酵培養(yǎng)與誘導(dǎo)表達(dá)：

將重組菌株EG/BL21(DE3)按1%接種量轉(zhuǎn)接到50mL?LB（含30μg/mL卡那霉素）液體培養(yǎng)基中于37℃震蕩培養(yǎng)；待OD₆₀₀為0.5時(shí)，加入0.1mM異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）誘導(dǎo)4h終止發(fā)酵；將發(fā)酵液在-80℃速凍，放冰水中緩慢融化完全，使用超聲波破碎細(xì)胞，10000r/min離心5min，取上清即為粗酶液；

（3）重組內(nèi)切葡聚糖酶的純化：

將上清加到Ni-NTA柱上，使帶有His標(biāo)簽的重組內(nèi)切葡聚糖酶結(jié)合到柱子上；使用pH8.0的洗脫溶液（含50mM?NaH₂PO₄、300mM?NaCl、250mMimidazole）將重組內(nèi)切葡聚糖酶從柱子上洗脫下來(lái)，并將酶液在超離心濃縮管中濃縮，獲得純度高于90%以上的酶蛋白。

4.一種重組內(nèi)切葡聚糖酶的應(yīng)用，所述內(nèi)切葡聚糖酶能夠應(yīng)用于生產(chǎn)纖維素酶，應(yīng)用于纖維素的降解。