[發明專利]一種內切葡聚糖酶編碼基因和重組酶及應用

無效

• 申請號: 201210480158.4
• 申請日: 2012-11-22
• 公開（公告）號: CN102936601A
• 公開（公告）日: 2013-02-20
• 發明（設計）人: 侯進慧;劉彤;陳宏偉;王富威
• 申請（專利權）人: 徐州工程學院
• 主分類號: C12N15/56
• 分類號: C12N15/56;C12N9/42;C12N15/70;C12N1/21;C12P19/14;C12R1/19
• 代理公司: 徐州市三聯專利事務所 32220
• 代理人: 周愛芳

技術領域

本發明屬于生物技術領域，涉及一種內切葡聚糖酶編碼基因和重組酶及應用。

背景技術

纖維素是生物圈中產量最豐富的一種碳水化合物資源，占植物干重的35%-50%，分布廣泛。纖維素呈長鏈狀高分子，由葡萄糖苷通過β-1,4糖苷鍵連接而成，分子量一般為50000-2500000，相當于300-15000個葡萄糖單位，是葡萄糖的一種重要貯存形式，但是由于降解困難，導致纖維素資源的利用率非常的低。纖維素大分子可被纖維素酶所降解。纖維素酶是一個酶系，根據其催化反應功能的不同,可以把纖維素分為內切葡聚糖酶（endo-1,4-β-D-glucanase，EC3.2.1.4,即C1酶），外切葡聚糖酶（1,4-β-D-glucan?cellobilhydrolase或exo-1,4-β-D-glucannase，EC.3.2.1.91），和β-葡聚糖苷酶（β-1,4-glucosidase，EC.3.2.1.21）簡稱BG。一般認為，內切葡聚糖酶是纖維素酶系中最重要的酶，可以作用于纖維素分子內的無定形區，隨機水解糖苷鍵，將長鏈纖維素分子截成短鏈狀，產生小分子纖維素，可以為外切酶提供大量的反應末端，同時還能水解小分子的纖維素寡糖。

纖維素酶的研究與開發是纖維素資源綜合利用的基礎。目前研究者對真菌的纖維素酶研究開發較多，而在細菌中開發高效纖維素酶系的研究要少很多。纖維素降解細菌的研究大多是芽胞桿菌類，在Pantoea?ananatis中的研究未有報道。隨著分子生物學、基因工程的迅猛發展,國內外均嘗試應用基因工程技術來構建高效纖維素降解菌株、開發新型高效的纖維素酶系。由于內切葡聚糖酶在纖維素酶系中的重要地位，因此需要通過生物技術方法加大對細菌內切葡聚糖酶的研究，構建重組內切葡聚糖酶工程菌，并開展酶學性質、酶產品的研究，以推動纖維素酶的應用和纖維素資源的開發利用。

發明內容

本發明的目的在于提供一種新型內切葡聚糖酶編碼基因eg的基因序列及其氨基酸序列。采用PCR方法克隆獲得內切葡聚糖酶編碼基因。

本發明的一種新型內切葡聚糖酶編碼基因eg，所述內切葡聚糖酶的基因序列為SEQ?ID?NO.1。

所述內切葡聚糖酶的基因eg是一個完整的開放閱讀框（ORF），該開放閱讀框以啟始密碼子ATG開始，以終止密碼子TGA結束，共包括1005bp。

本發明的一種新型重組內切葡聚糖酶，所述重組酶的氨基酸序列為SEQ?IDNO.2。

所述內切葡聚糖酶共334個氨基酸序列。

本發明的另一目的，在于提供一種新型重組內切葡聚糖酶EG。該重組酶具有很高的酶活性，達到2245U/mL。

上述重組內切葡聚糖酶EG的制備方法，包括如下步驟：

（1）重組內切葡聚糖酶菌株EG/BL21(DE3)的構建：

以F:CATATGAGAGTTAAGCCAGTGT和R:CTCGAGACGCTTTTCCTGATAA為PCR反應的引物；以PCR方法從菌株Pantoea?ananatis?P5（CGMCCNO.5356）基因組中克隆獲得內切葡聚糖酶編碼基因eg全長，將該基因通過限制性內酶NdeI和XhoI酶切后，連接到原核表達載體pET258中，構建重組質粒pETEG，轉化大腸埃希氏菌E.coli?BL21(DE3)感受態細胞，利用PCR反應檢測（引物為F和R）和限制性內切酶NdeI和XhoI雙酶切檢測兩種方法，篩選獲得高效表達重組內切葡聚糖酶的菌株，即重組大腸埃希氏菌EG/BL21(DE3)；

（2）重組菌株EG/BL21(DE3)的發酵培養與誘導表達：

將重組菌株EG/BL21(DE3)按1%接種量轉接到50mL?LB（含30μg/mL卡那霉素）液體培養基中于37℃震蕩培養；待OD₆₀₀為0.5時，加入0.1mM異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）誘導4h終止發酵；將發酵液在-80℃速凍，放冰水中緩慢融化完全，使用超聲波破碎細胞，10000r/min離心5min，取上清即為粗酶液；

（3）重組內切葡聚糖酶的純化：

將上清加到Ni-NTA柱上，使帶有His標簽的重組內切葡聚糖酶結合到柱子上；使用pH8.0的洗脫溶液（含50mM?NaH₂PO₄、300mM?NaCl、250mMimidazole）將重組內切葡聚糖酶從柱子上洗脫下來，并將酶液在超離心濃縮管中濃縮，獲得純度高于95%以上的內切葡聚糖酶蛋白。