[發明專利]一種櫛孔扇貝擔輪幼蟲細胞系的培養方法

無效

• 申請號: 201210480145.7
• 申請日: 2012-11-16
• 公開（公告）號: CN102965331A
• 公開（公告）日: 2013-03-13
• 發明（設計）人: 張志峰;晏萌;季愛昌;畢穎
• 申請（專利權）人: 中國海洋大學
• 主分類號: C12N5/07
• 分類號: C12N5/07
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明屬于細胞培養技術領域，尤其涉及一種櫛孔扇貝擔輪幼蟲細胞系的培養方法。

背景技術

截至目前國內外尚無人建立海洋雙殼類細胞的體外培養體系，將范圍擴展至軟體動物門類，目前僅有一個細胞系成功建立，來自一種淡水蝸牛。

細胞的取材：體外培養的細胞多取材于動物胚胎、成年動物組織、人體手術活體材料，幼蟲細胞是兼具胚胎細胞和幼蟲期特有細胞性質的高分裂能力的細胞，是一類具有體外培養前景的細胞來源。

蝦夷扇貝擔輪幼蟲細胞的體外培養。參考文獻：Primary?cell?culture?fromembryos?of?the?Japanese?scallop?Mizuchopecten?yessoensis(Bivalvia)(1991Cytotechnology)

貽貝面盤幼蟲細胞的體外培養。(備注：面盤幼蟲是擔輪幼蟲下一個發育階段。)參考文獻：Isolation?and?partial?characterization?of?myogeniccellsfrom?mussel?larvae?in?vitro(2000Tissue?Cell.)

紫貽貝擔輪幼蟲細胞的體外培養。參考文獻：Comparative?Characteristicof?Mytilus?Muscle?Cells?Developed?In?Vitro?and?In?Vivo.(2003Journalof?Experimental?Zoology.)

油黑菜蛤擔輪幼蟲細胞的體外培養。參考文獻：Muscle?and?neuronaldifferentiation?in?primary?cell?culture?of?larval?Mytilus?trossulus(Mollusca：Bivalvia)(2010Cell?Tissue?Research)

幼蟲細胞的解離方式：上述幼蟲細胞均采用無鈣水浸泡后再經0.25％或0.125％膠原酶解離的方式獲得單個的細胞。

幼蟲細胞的除菌方法：蝦夷扇貝，紫外線消毒海水并添加500U/ml青霉素和40μg/ml慶大霉素，培養基中添加40mg/l慶大霉素；油黑菜蛤，Percoll密度梯度離心法。

細胞傳代方式：目前尚無關于幼蟲細胞的傳代方法的報道，傳代培養的核心工作有兩方面，一是分割培養物，二是再次接種。把貼壁依賴型細胞從培養基質上解離下來的方法主要有：1).胰蛋白酶溶液消化；2).對于貼壁不牢的細胞可采用機械的振蕩法。

幼蟲培養基的優化：蝦夷扇貝幼蟲細胞培養基：L15基礎培養基；添加如下鹽離子使滲透壓達到1100毫滲透摩爾濃度：NaCl(18.05克/升)，KCI(0.29克/升)，CaCl₂·2H₂O(1.205克/升)，MgCl₂·6H₂O(5.481克/升)，MgSO₄·7H₂O(4.28克/升)。另添加如下成分：牛磺酸(25毫克/升)，葡萄糖(50毫克/升)，谷氨酰胺(100毫克/升)，胎牛血清(2％體積比)，慶大霉素(40毫克/升)。

擔油黑菜蛤幼蟲細胞培養基：L-15基礎培養基；胎牛血清(2％體積比)，胰島素(50毫克/升)，維生素E(1.75毫克/升)。

現有技術的缺點是無法實現貝類細胞的傳代培養。

發明內容

本發明提供了一種櫛孔扇貝擔輪幼蟲細胞系的培養方法，旨在解決現有技術無法實現貝類細胞的傳代培養的問題。

本發明的目的在于提供一種櫛孔扇貝擔輪幼蟲細胞系的培養方法，該培養方法包括以下步驟：

將單個櫛孔扇貝擔輪幼蟲細胞均勻分布在含有0.5毫升櫛孔扇貝擔輪幼蟲體外培養細胞專用培養液的直徑為35毫米細胞培養皿中，并放置到20-23℃的生化培養箱中培養，16-24小時后得貼壁的櫛孔扇貝擔輪幼蟲體外培養細胞；

根據櫛孔扇貝擔輪幼蟲體外培養細胞專用培養基的顏色變化，每3-7天替換櫛孔扇貝擔輪幼蟲細胞專用培養基2毫升，當櫛孔扇貝擔輪幼蟲體外培養細胞形成克隆時，挑取出來實現早期傳代；

當傳代后的櫛孔扇貝擔輪幼蟲體外培養細胞長滿細胞培養瓶底面后，采用機械傳代法完成櫛孔扇貝擔輪幼蟲體外培養細胞的傳代培養。

進一步，櫛孔扇貝擔輪幼蟲體外培養細胞專用高抗生素培養液中添加有2500-25000單位/毫升青霉素、2500-25000微克/毫升鏈霉素。